Plackett-Burman聯用響應面法優化超聲波-酸法提取狐臭柴果膠工藝

李揚,楊寧線,謝國芳,王艷秋,陽嬌,張明生*

1(貴州大學 生命科學學院,貴州 貴陽,550025) 2(山地植物資源保護與種質創新教育部重點實驗室,貴州 貴陽,550025)

果膠是植物初生細胞壁和中層細胞膜中的一類復合多糖,為復雜的天然高分子聚合物。果膠的相對分子質量為10 000～400 000其主要成分為由α-1,4-糖苷鍵鏈接的半乳糖醛酸與鼠李糖、半乳糖、阿拉伯糖等中性糖形成的聚合物。根據酯化程度的不同,果膠可分為高酯化度果膠(酯化度>50%)和低酯化度果膠(酯化度<50%)[1-2]。果膠具有凝膠、增稠和乳化等多種功能,是一種安全、實用的食品添加劑,可以從植物特定部位提取,如蘋果皮、香蕉皮和葵花籽盤等[3-5]。然而,有關狐臭柴葉片果膠提取的研究還很有限。

狐臭柴(PremnapuberulaPamp)屬馬鞭草科豆腐柴屬的落葉灌木,在我國主要分布于貴州、廣東、廣西、四川、重慶、云南等省區,生長于海拔500～1 200 m的常綠闊葉林下或路邊灌木林中[6]。安全性評估表明,豆腐柴屬植物的葉片既可用于功能食品開發又可作為提取果膠的材料,產品安全且具有較高營養,還能發揮保健作用[7]。本課題組前期工作中已建立狐臭柴種苗繁育技術[8]和種植示范基地,其果膠的開發利用是后續的重點工作。

目前,植物中果膠的提取方法有酸提醇沉法、草酸銨法、酶法、堿法、離子交換法、微波法、超聲波法等[9-12]。酸提醇沉法較為常規,在果膠工業生產中應用較多[13]。本研究采用了超聲波輔助與酸提醇沉結合的方法提取狐臭柴葉片果膠,利用超聲波的空化效應促使植物組織破壁、內含物充分溶出,之后通過低成本酸液提取果膠。本研究采用超聲波輔助法,在單因素試驗基礎上,運用Plackett-Burman試驗結合Box-Behnken響應面法優化提取條件以提高果膠得率,并對果膠的分子結構和理化性質進行分析,建立果膠高效提取優化工藝,以期為狐臭柴果膠產業化開發利用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗材料：狐臭柴(P.puberulaPamp)野生資源來自貴州省務川仡佬族苗族自治縣,經貴州大學熊源新教授鑒定,已在貴州大學實驗基地人工種植多年,狐臭柴葉片集中在8月份采摘。

檸檬酸,天津市永大化學試劑有限公司；D-(+)-半乳糖醛酸、D-葡萄糖、L-鼠李糖、D-半乳糖、D-阿拉伯糖、D-葡萄糖醛酸、D-甘露糖、D-木糖、L-巖藻糖,上海源葉生物科技有限公司；鹽酸羥胺、肌醇、酚酞、柑橘皮果膠,生工生物工程(上海)股份有限公司；1,1-二苯基-2-苦基肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH),東京化成工業株式會社；以上均為分析級。食品級果膠,河南萬邦實業有限公司。

1.2 儀器與設備

L18-Y68型破壁機,山東九陽股份有限公司；H4-20KR冷凍離心機,湖南可成儀器設備有限公司；101-3A型電熱鼓風干燥箱,天津市泰斯特儀器有限公司；超聲波細胞破碎儀,南京舜瑪儀器設備有限公司；Agilent 1260 Infinity 高效液相色譜儀、7890A-5975C氣質聯用儀,美國安捷倫科技有限公司；Nicolet iS50傅里葉變換紅外光譜儀,美國賽默飛世爾科技公司；TAXT plus質構儀,英國Stable Micro System公司；SepectraMax 190型微孔板檢測系統,美國美谷分子儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 葉片果膠提取工藝及果膠得率計算

取-80 ℃冰箱保存的凍葉于料理機加入酸提液打成勻漿,在設計的酸液pH、液料比、超聲時間、超聲功率、提取溫度和提取時間的條件下,用檸檬酸溶液提取5 g樣品,先使用超聲波細胞破碎儀處理樣品,再放入水浴鍋中隔水浸提,提取完成后6 000 r/min離心10 min,取上清液。加入1.2倍體積無水乙醇密封靜置6 h,用100目過濾網過濾,沉淀物再加20 mL 體積分數為95%乙醇進行脫色處理,攪拌均勻,密封靜置1 h后用100目過濾網過濾,取沉淀物于40 ℃鼓風干燥后磨粉,所得干燥品為果膠干粉,果膠提取率按公式(1)計算：

(1)

式中：m,果膠干燥品質量,g；m0,葉片質量,g。

1.3.2 葉片果膠單因素試驗設計

設定酸液pH 2.00、液料比12∶1、超聲時間15 min、超聲功率500 W、提取溫度80℃、提取時間90 min，固定此水平值，分別考查酸液pH(1.5、1.75、2.00、2.25、2.50)、液料比(8∶1、10∶1、12∶1、14∶1、16∶1)、超聲時間(5、10、15、20、25 min)、超聲功率(300、400、500、600、700 W)、提取溫度(70、75、80、85、90 ℃)、提取時間(30、60、90、120、150 min)對果膠得率的影響。

1.3.3 葉片果膠提取Plackett-Burman試驗設計

根據前期單因素預試驗結果,對酸液pH、液料比、超聲時間、超聲功率、提取溫度和提取時間共6個因素進行考查,每個因素選取高低2個水平,另設3個虛擬列,設計N=12的Plackett-Burman試驗(表1)。

表1 果膠提取Plackett-Burman試驗設計因素及水平

1.3.4 葉片果膠提取Box-Behnken響應面試驗設計

在1.3.3試驗基礎上,以pH、液料比、超聲功率和提取時間為自變量,通過Box-Behnken設計4因素3水平的響應面試驗(表2),以果膠提取率為響應值,考查各因素對于響應值的影響程度,以得出最佳工藝條件。

表2 果膠提取Box-Behnken響應面試驗設計因素與水平

1.3.5 葉片果膠半乳糖醛酸含量和酯化度測定

果膠的半乳糖醛酸采用咔唑-硫酸法[14]測定;果膠的酯化度采用滴定法[15]測定。

1.3.6 葉片果膠分子質量與單糖組成測定

果膠分子質量測定方法：采用高效凝膠滲透色譜法測定果膠樣品的分子質量分布,色譜檢測條件：RI示差折光檢測器；PL aquagel-OH MIXED 8 μm色譜柱；流動相：0.1 mol/L NaNO3溶液；流速1 mL/min；柱溫30 ℃。稱取果膠樣品2 mg,溶于1 mL去離子水中,經0.45 μm水相微孔濾膜過濾后吸取100 μL樣品溶液依照色譜條件進樣。

果膠酸水解物和衍生物的制備方法參考晉睿沖[16]的方法,使用面積歸一法[17]計算果膠中的單糖比例。

色譜條件：DB-5石英毛細管柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm)；升溫程序：柱初始溫度140 ℃。以4 ℃/min升到240 ℃,進樣口溫度250 ℃,載氣流速1 mL/min,分流比為50∶1。質譜條件：離子源溫度230 ℃,電離方式為EI,電子能量70 eV,掃描質量范圍29～450 amu。

1.3.7 葉片果膠紫外及紅外光譜分析

紫外光譜分析：配制質量分數0.25%的果膠溶液,取適量溶液于石英比色皿中,使用紫外分光光度計進行掃描,掃描波長為200～400 nm,掃描頻率為2 nm/s。

紅外光譜分析：將果膠粉末樣品直接放在ATR晶體上,壓力塔加壓測試。用傅里葉紅外光譜儀進行掃描,波譜的分辨率為4 cm-1,掃描100次,波譜的掃描范圍為4 000～500 cm-1。

1.3.8 葉片果膠凝膠質構測定

果膠的凝膠制備方法：分別取狐臭柴葉片、柑橘標準品果膠和食品級果膠樣品0.3 g到50 mL燒杯,加21 g蔗糖一起溶于去離子水,調整最后體積為30 mL。使用2 mol/L的檸檬酸調節pH至4.8,90 ℃隔水加熱30 min,溶液在室溫靜置24 h至形成凝膠。

果膠的凝膠質構測定參考MARIY等[18]的方法。凝膠的質構測定條件：壓縮測試使用柱形探頭,采用TPA模式(下壓5 mm,觸發力2 g,測前速度、測試速度和測后速度均為0.5 mm/s),獲得硬度、彈性、黏性、咀嚼性、恢復力等指標。

1.3.9 葉片果膠抗氧化性測定

參考趙磊等[19]的方法,采用體外抗氧化DPPH法測定果膠和維生素C的抗氧化活性,結果用EC50表示,即DPPH自由基清除率達到50%所需要的樣品濃度。

1.3.10 數據處理

使用Design-Expert 10軟件分析測試結果,以優化每個因素的最佳條件,并根據預測結果進行驗證實驗。實驗數據采用Excel 2016和Origin 2018進行分析處理。

2 結果與分析

2.1 不同因素對葉片果膠提取率的影響

單因素試驗表明,果膠提取率隨pH增大先升高后降低,在pH為1.75時果膠提取率達到最大值(圖1-a),這可能是由于酸性環境加大了果膠在提取液中的溶解性,但酸度過高會降解果膠分子從而使提取率降低；果膠提取率隨液料比的增加先升高后降低,但減幅平緩(圖1-b),這是因為液料比太小時,溶液密度大,提取液與葉片不能充分反應,在液料比為12∶1時果膠提取率達到最大值；提取率隨超聲時間的延長而先升高后降低,變化較為平緩,在超聲時間為10 min時果膠提取率達到最大值(圖1-c),這可能是由于超聲時間過長,破壞了果膠的大分子結構,使提取液中的果膠不能完全在乙醇溶液中析出；提取率隨超聲功率的增大而先升高后降低,變化較為平緩,在超聲功率為400 W時果膠提取率達到最大值(圖1-d),這可能是由于隨著超聲波的功率加大,空化作用增強,使葉片細胞內容物更加充分析出,但超聲波功率過大,過強的破碎效應使提取液中雜質增多,果膠中的半乳糖醛酸含量降低,故提取率降低；提取溫度在70～85 ℃范圍內,果膠提取率隨溫度升高而升高,這與分子熱運動加劇和檸檬酸的解離程度增強有關,提取溫度85 ℃時,果膠提取率達到最大(圖1-e),當提取溫度>85 ℃時,提取率下降,這可能是因為溫度提升破壞了果膠結構,致使果膠降解所致；提取率隨提取時間的延長而先升高后降低,最優的提取時間是90 min(圖1-f)。

a-pH；b-液料比；c-超聲時間；d-超聲功率；e-提取溫度；f-提取時間

2.2 影響葉片果膠提取率的關鍵因素

在單因素試驗的基礎上,通過Plackett-Burman試驗和方差分析(表3、表4),從pH、液料比、超聲時間、超聲功率、提取溫度和提取時間6個因素中篩選獲得影響果膠提取率的關鍵因素。

表3 Plackett-Burman試驗設計及果膠提取率

利用Design-Expert 10軟件對表3數據進行處理,模型F值為56.36,模型極顯著(P<0.01),表明該模型具有重要意義,R2=0.915 9,說明91.59%的試驗數據可用該模型解釋。提取率影響因素依次為X1>X6>X4>X2>X5>X3,其中X1、X6對提取率影響極顯著(P<0.01),X4對提取率影響顯著(P<0.05),X2對提取率的影響接近顯著水平(表4)。因此,選取pH、反應時間、超聲功率與液料比4個因素進行Box-Behnken試驗。

表4 果膠提取Plackett-Burman試驗方差分析

2.3 葉片果膠提取的最優條件

2.3.1 Box-Behnken試驗優化果膠提取工藝

表5 Box-Behnken試驗設計及果膠提取率響應值

表6 果膠提取Box-Behnken試驗方差分析

2.3.2 各因素交互作用對果膠得率影響的響應面分析

采用Design-Expert 10軟件對試驗結果進行響應面圖繪制,通過響應面圖可直觀地分析各因素及因素相互之間的交互作用對響應值的影響。各因素之間響應面3D圖和等高線圖能直觀反映出其相互作用的強弱,響應面曲面坡度越陡峭,等高線圖越偏橢圓形,因素之間交互作用越存在顯著性差異,反之則表示兩因素的交互作用無顯著性差異。

圖2顯示了pH、反應時間、超聲功率和液料比中任意2個變量取0水平時其余2個變量對果膠得率的影響。3D響應面圖均成拋物狀,曲面有最高點,容易出現最大值。由圖2可知,AB的響應面曲線最陡,且等高線密集,因此AB的交互作用對狐臭柴果膠得率的影響最為顯著；依次類推,其次是CD與AC響應曲面,CD與AC的交互作用對狐臭柴果膠得率也有一定的影響；BD、BC和AD的響應曲面較為平緩,等高線疏松,BD、BC和AD的交互作用對狐臭柴果膠得率的影響較小。交互作用對果膠得率的影響大小順序為：AB>CD>AC>BD>BC>AD。

a-pH與反應時間；b-pH與超聲功率；c-pH與液料比；d-反應時間與超聲功率；e-反應時間與液料比；f-超聲功率與液料比

2.3.3 最佳條件的預測及驗證實驗

通過回歸模型的預測得到超聲波輔助-酸法提取果膠的最佳工藝為：pH 1.90、反應時間95.87 min、超聲功率436.92 W、液料比12.54∶1。此時果膠的理論得率最大為11.71%。由于實驗的客觀條件和便于操作性,把最優條件修正為：pH 1.9、反應時間95.0 min、超聲功率450.0 W、液料比12.5∶1。在此條件下進行3次平行實驗進行驗證,狐臭柴果膠平均得率為(11.53±0.16)%,與理論預測值(11.71%)誤差值僅為1.54%,證實了該模型的有效性。

2.4 葉片果膠純度與酯化度判斷

果膠的主要組成成分為半乳糖醛酸,所以半乳糖醛酸含量可以反映果膠的純度,經測定,狐臭柴葉片果膠的半乳糖醛酸含量為(70.64±0.06)%,符合GB 25533—2010《食品添加劑果膠》[20]要求(半乳糖醛酸含量>65%)。酯化度為(77.77±0.21)%,為高酯果膠(酯化度>50%)。

2.5 葉片果膠分子質量大小、單糖組成與結構域分析

超聲波-酸法提取的葉片果膠的重均分子質量(Mw)為87.90 kDa,數均分子質量(Mn)為56.06 kDa,分子質量分布(Mw/Mn)為1.57。此方法所提取果膠分子質量偏小但分布較為均一,可能是由于在超聲波作用下分子片段被隨機打斷,導致分子質量減小。

從單糖混合標準衍生物以及果膠中性單糖衍生物的選擇離子總離子流圖(圖3)可以看出,各類型果膠中中性單糖衍生物整體均能達到基線分離,且峰型尖銳對稱,滿足定性定量。

a-9種單糖混標；b-果膠水解物

果膠主要包括4個結構域：同聚半乳糖醛酸(homopolygalacturonic acid，HG)，鼠李糖半乳糖醛酸聚糖I型(rhamnose galacturonosan type I，RG-I)、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖Ⅱ型(rhamnose galacturonosan type Ⅱ，RG-II)和木糖半乳糖醛酸聚糖(xylose galacturonic glycan，XG)[21]。HG是果膠的主要結構,由線性半乳糖醛酸鏈組成,也稱為果膠主鏈[22]；RG-I與RG-II稱為果膠側鏈[23]。果膠的單糖組成對其性質和生物活性具有重要影響,側鏈的存在往往限制了鏈間的相互作用,進而影響凝膠形成過程中鏈間的結合[24-25]。

通過分析果膠的離子流圖,狐臭柴果膠中含有鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、木糖、葡萄糖和果糖,各單糖的摩爾百分含量分別為：12.08%、15.99%、14.82%、12.93%、6.28%、31.29%、6.29%。由單糖組分可以得出,狐臭柴果膠中含有HG、RG-I和RG-II這3種結構,可能還有XG結構。本研究中,超聲波輔助酸提法提取的果膠鼠李糖含量較低,可以反映出RG-I與RG-II兩種側鏈含量較低,這可能是狐臭柴果膠凝膠性能較好的重要原因。

2.6 葉片果膠光譜特征

2.6.1 葉片與標品果膠紫外特征比較

紫外光譜可以快速準確地測定果膠特征,狐臭柴果膠與柑橘標品果膠曲線趨勢相似,但狐臭柴果膠在260和280 nm周圍有吸收峰,說明狐臭柴粗品果膠中可能含有少量核酸和蛋白質(圖4-a)。

2.6.2 葉片果膠官能團分析

紅外光譜可以檢測化合物官能團組成,可以準確判斷化合物的分類。狐臭柴果膠的紅外光譜圖通過與化學專業數據庫中果膠紅外光譜圖的特征峰比對發現[26],其譜峰位置、譜峰透過率、半峰寬和峰差相似,由此可以認為紅外光譜圖符合常規果膠光譜特征(圖4-b)。

a-紫外光譜圖；b-紅外光譜圖

在4 000～1 330 cm-1特征頻率區：3 285 cm-1周圍呈現下降的糖類O—H強烈伸縮振動曲線,在O—H伸縮振動頻率區會出現多個吸收峰,這些吸收峰往往重疊在一起,形成寬的吸收帶；在2 929 cm-1處表現出糖類C—H中等強度的伸縮振動；在1 486～1 318 cm-1出現了幾個吸收峰,表現出糖類C—H的變角振動,CH3和CH2變角振動頻率位于高頻一側,CH變角振動頻率位于低頻一側。在1 330～400 cm-1的指紋區：1 179～1 009 cm-1之間的譜帶表現出糖類C—OH和C—O—C的吸收峰,但因為這2個基團在同一區間,所以無法進行明確的歸屬；1 009～842 cm-1之間出現了幾個吸收峰表現出糖類C—O—C的對稱伸縮振動。這些吸收峰均屬多糖化合物所特有的特征性吸收峰[27],可以判定所提取的為果膠。

2.7 葉片與其他果膠質構比較

狐臭柴鮮葉果膠與食品級果膠、柑橘果膠標準品和狐臭柴干葉果膠的凝膠質構比較發現,狐臭柴果膠所制凝膠的硬度、黏性與咀嚼性高于同樣條件下其他幾種果膠所制凝膠,有非常好的凝膠、增稠作用,狐臭柴果膠的恢復力低于其他果膠,彈性大小相似(表7)。

表7 果膠的凝膠質構

2.8 葉片果膠與維生素C抗氧化活性能力比較

DPPH是一種比較穩定的自由基,在波長517 nm處有特征吸收峰,常用于評價抗氧化成分的自由基清除能力。DPPH自由基清除劑能提供氫并形成穩定的非自由基分子[28]。研究表明,果膠等多糖類物質具有自由基清除能力,可能是因為其屬于氫供體物質,與自由基反應可以生成更穩定的產物并終止自由基鏈反應[29]。體外抗氧化DPPH法測定果膠和維生素C的抗氧化活性結果表明,狐臭柴中提取的果膠有一定的DPPH自由基清除能力,果膠的線性方程為y=0.001 3x+0.149 9(R2=0.992 2),代入方程得出果膠的EC50值為(269.31±0.26)μg/mL；維生素C的線性方程為y=0.00 19x+0.201 7(R2=0.998 5),代入方程得出維生素C的EC50值為(157±0.14)μg/mL。EC50值越低,該物質清除自由基的能力越強,狐臭柴果膠的EC50是維生素C的兩倍左右,具有計量依賴的關系[30]。蘋果、柑橘果膠同樣具有抗氧化能力[31-32],但經過比較發現,狐臭柴果膠抗氧化能力強于這2種果膠。

3 結論

目前對狐臭柴果膠提取的相關研究非常少,只有本實驗室前期對狐臭柴干葉和鮮葉酸提法的工藝進行研究,但沒有對狐臭柴果膠的分子結構與理化性質等做評價[33-34]。在本研究中,狐臭柴葉片未經脫水干燥,直接進行果膠提取,所得果膠不僅凝膠、增稠功能強于干葉提取果膠,而且工藝上省去了鮮葉烘干為干葉再磨粉的步驟,操作工藝簡化、果膠品質提升,為狐臭柴的資源利用提供了新途徑。

在本試驗中,首先采用單因素試驗,分析考查不同因素對果膠提取率的影響,確定合適的條件范圍,再利用Plackett-Burman試驗設計結合Box-Behnken響應面法對提取工藝進行優化。結果表明,關鍵因素為pH、液料比、超聲功率、反應時間,利用Design-Expert軟件對試驗結果進行分析,得出最佳工藝條件：pH 1.90、反應時間95.87 min、超聲功率436.92 W、液料比12.54∶1,此時果膠的理論得率最大為11.71%。基于實驗的客觀條件和便于操作性,把最優條件修正為：pH 1.9、反應時間95.0 min、超聲功率450.0 W、液料比12.5∶1,此時果膠提取率11.53%。狐臭柴果膠是一種較為均一的低分子質量果膠,通過對單糖成分分析,狐臭柴果膠中單糖的摩爾百分含量為：12.08%鼠李糖、15.99%阿拉伯糖、14.82%半乳糖、12.93%甘露糖、6.28%木糖、31.29%葡萄糖、6.29%果糖,狐臭柴果膠側鏈含量低,凝膠性較好。通過紫外與紅外光譜分析,狐臭柴果膠符合果膠特征,可以推斷出所測樣品為純度比較高的果膠粗產品。測定提取的果膠的理化性質：半乳糖醛酸含量為70.64%,符合其含量≥65%的要求；酯化度為77.77%,為高酯果膠；凝膠質構結果表明,狐臭柴果膠有很好的凝膠、增稠功能；狐臭柴果膠DPPH清除率EC50為(269.31±0.26)μg/mL,有良好的抗氧化活性。果膠作為膠凝劑、增稠劑和穩定劑,廣泛應用于食品醫藥中[35]。狐臭柴果膠相對食品果膠其膠凝、增稠作用更加優越,非常適合工業開發利用,具有作為功能成分在食品和醫藥領域進一步發展的潛力。