熱滅活鼠李糖乳桿菌HN001對DSS誘導的小鼠結腸炎保護作用

王東旭,尹成男,葉華,郭元新*

1(江蘇科技大學 糧食學院,江蘇 鎮江,212100)2(合肥極世茗香生物科技有限公司,安徽 合肥,230088)

炎癥性腸病是一種多因素的腸道炎癥性疾病,其發病因素主要包括遺傳、環境因素、腸黏膜屏障完整性和功能異常、免疫調節以及腸道微生態異常等[1]。為了研究炎癥性腸病的發病機制和評價其治療效果,葡聚糖硫酸鈉鹽(dextran sulfate sodium,DSS)誘導的小鼠結腸炎模型被廣泛應用[2]。益生菌是一類可用于緩解人體各種慢性疾病,如慢性先天性炎癥、高脂血癥、糖尿病、肥胖,結腸炎等[3-4]的微生物。有證據表明,口服活性益生菌可作為預防和緩解結腸炎的有效途徑,其主要機制為抑制炎癥、改善腸屏障功能障礙、提高免疫調節活性及調節腸道微生態平衡等[5-6]。動物模型研究表明補充活性鼠李糖乳桿菌可以改善DSS誘導的實驗性小鼠結腸炎[7]。但值得注意的是在某些群體中使用活菌出現感染的安全問題,例如新生兒[8-9]和易受感染的患者[10]。因此,尋找解決這一問題的有效途徑引起了學者的廣泛關注。

最近,有研究報道熱滅活的益生菌也能對宿主產生有益的影響,例如熱滅活的發酵乳桿菌CECT5716和短乳桿菌SBC8803對小鼠結腸炎均具有改善作用[11-12]。此外,多項體外和體內研究表明熱滅活的鼠李糖乳桿菌GG也具有改善結腸炎的功能作用[13-15]。與活性益生菌相比,熱滅活益生菌更利于工業生產和消費者使用；同時具有產品保質期延長和便于儲存運輸等優點,因此熱滅活益生菌具有良好的應用前景。鼠李糖乳桿菌HN001(LactobacillusrhamnosusHN001)是1株存在于人體腸道中的不產生芽孢的厭氧性革蘭氏陽性菌,它是全球研究最多的第3代益生菌之一。然而,熱滅活的鼠李糖乳桿菌HN001(HK-HN001)對炎癥性腸病的作用影響尚不清楚。本研究以DSS誘導的小鼠結腸炎為研究模型,探討HK-HN001對結腸炎的保護作用,為研發活性益生菌代替產品提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

活性鼠李糖乳桿菌HN001凍干粉,美國杜邦公司；DSS,大連美倫生物科技有限公司；總超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase,T-SOD)測試盒、谷胱甘肽(glutathione,GSH)測試盒、丙二醛(malondialdehyde,MDA)測試盒、髓過氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)測試盒,南京建成生物工程研究所；白細胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)測試盒、白細胞介素6(interleukin-6,IL-6)測試盒、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)測試盒,美國BD Biosciences公司；脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)、二胺氧化酶(diamine oxidase,DAO)測試盒,美國BioVision公司；RNAiso Plus總RNA提取試劑盒、PrimeScriptTMRT反轉錄試劑盒及SYBR Premix Ex熒光定量試劑盒,日本TaKaRa公司；多聚甲醛固定液、蘇木精和伊紅染料、石蠟及切片等,武漢賽維爾生物技術有限公司；DEPC水,北京索萊寶科技有限公司；氯仿、異丙醇、乙醇、二甲苯,國藥集團；本文所使用的基因引物,上海Generay公司。

1.2 儀器及設備

SpectraMax M4多功能酶標儀,美國Molcular Devices公司；EG1150自動石蠟包埋切片機,德國Leica公司；ND2000核酸定量儀、Forma900超低溫冰箱,美國Thermo-Fisher 公司；S1000型PCR儀、CFX96實時熒光定量PCR儀,美國Bio-Rad公司；3-18KS高速冷凍離心機,美國Simga公司；Scientz-48高通量組織勻漿儀,寧波新芝公司；多量程單道可調移液器,法國Gilson公司；MH-2800a多功能恒溫器,天津奧特賽恩斯公司；雙人單面凈化工作臺,蘇州凈化公司；MLS-3780高壓滅菌鍋,日本SANYO公司。

1.3 實驗動物

雄性C57BL/6小鼠(8周齡),體質量(20±2)g,購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司。所有小鼠飼養在(22±2)℃和相對濕度60%～80%的SPF級環境。所有動物實驗均按照中華人民共和國科學技術部《實驗室動物飼養與使用規范》進行,該研究遵循的程序符合江蘇科技大學實驗動物倫理委員會所制訂的倫理學標準,批準文號20200302。

1.4 試驗方法

1.4.1 滅活菌粉的制備

準確稱取10 g活性鼠李糖乳桿菌HN001凍干粉裝入10 mL無菌離心管中,利用高壓滅菌鍋于121 ℃、0.12 MPa下熱殺菌處理10 min,并用平板菌落計數法檢測滅活效果,獲得HK-HN001粉末。隨后利用純水配制質量濃度2 g/L的HK-HN001水溶液,分裝低溫保存備用。

1.4.2 實驗動物處理

將24只小鼠隨機分為3組(每組8只),分別為對照組、模型組和HK-HN001保護組。其中對照組小鼠正常飲水；模型組小鼠飲用20 g/L的DSS水溶液構建結腸炎模型；HK-HN001保護組小鼠飲用20 g/L的DSS水溶液的同時通過移液器飼喂100 μL(相當于200 mg/kg 體質量)上述HK-HN001水溶液每日1次；各組處理均連續進行3周,實驗過程中每日記錄動物體質量1次。實驗結束后首先利用水合氯醛溶液麻醉小鼠,通過眼球取血法收集血清樣本,隨后利用CO2麻醉法處死小鼠。解剖采集小鼠結腸組織,測量結腸長度后分別低溫保存用于后續分析。

1.4.3 疾病活動指數分析

通過每日監測實驗動物體質量、直腸出血情況和糞便形態進行疾病活動指數(disease activity index,DAI)評分,具體分值如表1所示。

表1 疾病活動指數(DAI)評分表

1.4.4 結腸組織氧化逆境程度分析

結腸勻漿的制備：按照每0.1 g結腸組織與1 mL冰冷的組織勻漿液(150 mmol/L PBS,pH 7.2,1 mmol/L EDTA·Na2)的比例利用高通量組織勻漿儀對結腸組織充分勻漿,4 ℃、15 000 g/min離心15 min以除去細胞碎片和細胞核。取上清液并保存于-80 ℃待用。根據相關試劑盒操作說明書,檢測上清液中T-SOD和MPO的活力,以及使用相應試劑盒測定GSH和MDA的含量,其中以牛血清白蛋白為標準,用Bradford法測定蛋白水平。

1.4.5 結腸組織切片制作及病理觀察

生物樣本經組織固定液固定72 h后進行常規梯度脫水,隨后將結腸組織利用自動石蠟包埋機進行浸蠟和包埋,隨后修整蠟塊后利用切片機將石蠟塊切成4 μm厚的切片,然后根據標準方法進行蘇木精和伊紅染色,最后在光學顯微鏡下進行結腸病理觀察并拍照分析(20×)。

1.4.6 結腸組織炎癥因子表達分析

使用ELISA試劑盒按照試劑盒說明書分別檢測結腸勻漿液中IL-1β、IL-6和TNF-α的濃度。利用多功能酶標儀在450 nm波長處讀取標準品及各檢測樣本的吸光度,測得的數據運用ELISACalc軟件進行計算處理,單位為pg/g組織蛋白。

1.4.7 結腸組織腸道通透性分析

利用實驗動物血漿中LPS濃度和DAO的活力作為指標評價腸道通透性。利用適量的血清樣本,嚴格按照相關的試劑盒說明書操作,利用多功能酶標儀讀取吸光度從而測定血清中LPS和DAO的含量,單位分別為ng/mL和U/mL。

1.4.8 結腸組織總RNA的提取與實時定量PCR檢測

稱取50 mg的結腸組織加入1.0 mL RNAiso Plus提取液,使用高通量勻漿儀將樣品充分研磨后,將得到的樣品組織勻漿4 ℃、15 000 r/min離心15 min,收集上清液并加入500 μL氯仿進行提取。將提取液4 ℃、12 000 r/min離心15 min,再次收集上清液,并用等體積的異丙醇于-20 ℃條件下助沉30 min；隨后在4 ℃、12 000 r/min的條件下離心10 min,棄去上清液；隨后利用體積分數75%乙醇對沉淀進行清洗,再于4 ℃、12 000 r/min條件下離心10 min,使用200 μL的DEPC水溶解沉淀獲得總RNA提取。利用核酸定量儀檢測總RNA濃度,使用DEPC水將原液稀釋至50 ng/μL后,按照逆轉錄試劑盒說明書在超凈臺中于冰水浴條件下配制逆轉錄反應液,然后在PCR儀內按逆轉錄程序,即37 ℃、15 min和85 ℃、5 s進行逆轉錄,以獲得cDNA樣品。隨后按照實時定量試劑盒說明書在超凈臺中于冰浴條件下配制反應液,然后在實時定量PCR儀中按優化的擴增條件進行實時定量檢測。使用的引物序列如下：ZO-1(正向：5′-ACCACCAACCCGAGAAG-3′,反向：5′-CAGGAGTCATGGACGCAC-3′)；Occludin(正向：5′-TTGAAAGTCCACCTCCTT-3′,反向：5′-CCGGATAAAAA-GAGTACG-3′)；Claudin-1(正向：5′-GGCCTGATAGC-GAGCAC-3′,反向：5′-GTGACGCACTCCATCCAGA-3′)；E-cadherin(正向：5′-CAGGTCTCCTCATGGCTT-3′,反向：5′-CTTCCGAAAAGA-AGGCTG-3′)；β-actin(正向：5′-GCTGAGAGGGAA-ATCGTGCGTt-3′,反向：5′-ACCGCTCGTTGCCAATAG-TGA-3′)。

1.4.9 統計分析

所有數據的差異分析使用One-way ANOVA。根據Bartlett’s檢驗差異是否具有顯著性而選擇Dunnett’s或Tukey’s進行各組間的多重比較檢驗。數據表示方法為平均值±標準誤差(mean ± SEM),當P<0.05時,組間存在顯著差異。所有數據處理及分析軟件使用GraphPad(Prism,USA)。

2 結果與分析

2.1 HK-HN001對結腸炎小鼠病理的影響

DSS誘導的小鼠結腸炎模型其主要病理特征為小鼠出現明顯體質量減輕、腹瀉或糞便疏松和可見的血便以及結腸長度縮短及損傷。由圖1-a所示,模型組的DAI評分逐漸增加,在試驗觀察期結束時達到最大值,而HK-HN001保護組與模型組相比較,DAI評分從第10天開始顯著降低直到實驗觀察期結束。這一結果說明補充HK-HN001顯著改善了由DSS誘導引起的小鼠的體質量減輕、腹瀉和血便。通過解剖測量各組小鼠結腸長度發現,模型組小鼠結腸長度顯著降低(P<0.001),而HK-HN001保護組顯著改善了DSS誘導的小鼠結腸縮短(P<0.01)(圖1-b)。此外,病理分析結果顯示,DSS處理后的小鼠結腸組織出現黏膜腸腺消失、炎性細胞浸潤、上皮細胞腫脹和細胞質疏松以及黏膜下層結締組織增生等情況。而HK-HN001補充顯著改善這些病理特征(圖1-c)。

a-DAI評分；b-結腸長度；c-結腸病理切片

2.2 HK-HN001對結腸炎小鼠氧化逆境的影響

結腸組織的氧化逆境是DSS誘導的小鼠結腸炎中的特征性分子變化,其中MPO是炎癥、組織損傷和中性粒細胞浸潤的重要生物標志物,主要反映炎癥和氧化應激水平。有研究表明急性結腸炎往往伴隨著氧化應激的增加,而降低結腸組織中的氧化應激是減輕結腸炎的潛在干預措施之一[16]。如圖2所示,DSS顯著誘導了小鼠結腸組織的氧化逆境,具體表現為結腸組織中T-SOD的活力降低、GSH含量顯著降低,同時伴隨著MPO活力和MDA含量的顯著升高。然而,與模型組相比,HK-HN001保護組結腸組織中的T-SOD活力(P<0.05)和GSH含量(P<0.01)顯著增加,而MPO活力(P<0.01)和MDA含量(P<0.01)顯著減低。這些研究結果表明,HK-HN001的補充可以改善DSS誘導的小鼠結腸氧化應激。

a-T-SOD(U/mg組織蛋白)、GSH(nmol/mg組織蛋白)；b-MPO(U/mg組織蛋白)、MDA(nmol/mg組織蛋白)

2.3 HK-HN001對結腸炎小鼠炎癥反應的影響

氧化應激可以刺激多種促炎細胞因子的產生,最終導致結腸炎癥。IL-1β、IL-6和TNF-α是結腸組織釋放的主要促炎細胞因子,可能在結腸炎的發生發展中起重要作用,因此本文通過ELISA測量結腸組織中促炎細胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的水平來判斷HK-HN001對結腸炎小鼠炎癥反應的影響。結果表明,DSS處理后結腸組織中促炎細胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的水平均顯著增加(P<0.001),然而補充HK-HN001的實驗組顯著降低了小鼠結腸組織中促炎細胞因子IL-1β(P<0.01)、IL-6(P<0.01)和TNF-α(P<0.001)的水平(圖3)。這些結果提示,降低結腸的氧化應激、調節結腸組織的促炎細胞因子表達和黏膜免疫可能是HK-HN001改善DSS小鼠結腸炎的潛在機制之一。

圖3 HK-HN001對DSS誘導的結腸炎小鼠炎癥反應的影響

2.4 HK-HN001對結腸炎小鼠結腸通透性的影響

結腸細胞可以表達緊密連接蛋白,主要包括ZO-1、Occludin、Claudin-1和E-cadherin等,它們形成天然的腸屏障,通過固有層阻止毒素和微生物抗原的外泄。研究表明,緊密連接蛋白表達的降低可以加速實驗性結腸炎的發生發展[17]。血清LPS水平和DAO活力已被廣泛用于評價腸道機械屏障的完整性和受損傷程度,腸屏障功能受損時血液中LPS水平顯著增加。如圖4所示,與對照組相比,模型組小鼠血清中LPS含量顯著增加(P<0.01),同時DAO的活力顯著降低(P<0.01),而HK-HN001保護組小鼠血清中LPS含量顯著低于模型組(P<0.01),且血清中DAO的活力相對于模型組顯著升高(P<0.05)。此外,利用實時定量PCR進一步分析了各組小鼠結腸組織中關鍵緊密連接蛋白的轉錄表達水平。結果顯示,與對照組相比,模型組小鼠結腸組織中ZO-1(P<0.01)、Occludin(P<0.01)、Claudin-1(P<0.01)和E-cadherin(P<0.05)的轉錄表達水平均顯著被抑制。而在HK-HN001保護組中,HK-HN001補充顯著增強小鼠結腸組織中ZO-1(P<0.05)、Claudin-1(P<0.05)和E-cadherin(P<0.05)轉錄表達水平(圖4-c)。這些結果表明HK-HN001補充可改善結腸炎小鼠的結腸通透性、降低血液中LPS水平,同時通過調節腸道緊密連接蛋白基因的表達促進腸屏障功能。

a-血清LPS水平；b-血清DAO含量；c-結腸緊密連接蛋白基因表達水平

3 討論與結論

最近研究指出熱滅活益生菌對宿主產生有益影響,這很可能是由于腸道細胞能夠識別特定的細菌成分由黏液相關淋巴組織介導免疫反應,這些成分包括具有免疫刺激活性的DNA、細胞壁成分(如肽聚糖或脂磷壁酸)以及胞內和胞外多糖產物[18]。同時越來越多的證據表明,活性的和熱滅活的益生菌均可保護結腸炎實驗動物的上皮屏障[19-20]。例如,熱滅活鼠李糖乳桿菌OLL2838已經被證明可以保護結腸炎小鼠的黏膜屏障通透性缺陷[7]。利用大腸桿菌C1845感染的Caco-2/TC7細胞單層模型,熱滅活的嗜酸乳桿菌LB及其培養基抵消了大腸桿菌C1845誘導的細胞間隙通透性的增加[21]。腸細胞可以表達緊密連接蛋白,包括ZO-1、Claudins和Occladin,它們形成天然的腸道屏障,通過固有層阻止毒素和微生物抗原[17]。研究表明實驗性結腸炎的發生伴隨著緊密連接蛋白表達的降低[22]。在本研究中DSS增加通透性(血清LPS)同時下調緊密連接蛋白的表達,而HK-HN001顯著減輕DSS誘導的小鼠結腸屏障功能異常,這些結果說明,HK-HN001可以通過調節緊密連接蛋白的表達促進腸屏障功能的改善。本研究未做等量的活菌功效對比研究,但熱滅活菌有其特殊的應用范圍,例如可加入熱飲或加熱便當中食用,因此雖有不足但本研究仍具有積極的意義和應用價值。總之,HK-HN001對DSS誘導的小鼠結腸炎模型具有保護作用,能恢復結腸炎導致的結腸長度的減少并緩解結腸炎相關癥狀,同時減輕DSS誘導的結腸炎小鼠組織的病理學改變。此外,HK-HN001對DSS誘導的結腸氧化損傷具有保護作用,同時能夠降低結腸炎小鼠炎癥細胞因子的含量；HK-HN001還能夠改善結腸炎小鼠結腸的通透性并修復結腸屏障功能紊亂。綜上所述,HK-HN001對DSS誘導的小鼠結腸炎具有保護作用,研究結果為熱滅活益生菌食品開發及營養應用提供了理論支持。