嗜熱玫瑰紅球菌嗜熱脂肪酶的重組表達與酶學性質研究

周艷杰,耿鵬,時祎,顧正華,辛瑜,石貴陽,張梁*

1(糧食發酵工藝與技術國家工程實驗室(江南大學),江蘇 無錫,214122) 2(江南大學 生物工程學院,江蘇 無錫,214122)

脂肪酶(EC.3.1.1.3)是自然界中最有潛力的工業酶之一,屬于α/β水解超家族,具有多種催化能力,催化中心由親核基團絲氨酸、2個殘基天冬氨酸和組氨酸形成的催化三聯體和陰離子氧洞組成[1],在脂水界面存在的情況下,活性位點被激活,產生構象變化,使底物進入活性位點[2],不僅能催化甘油三酯水解反應,而且可以催化酯合成、酯交換、醇解、酸解等反應[3],在生物清洗劑、手性藥物拆分、生物傳感器和生物柴油合成等方面引起了人們的廣泛關注[4-5]。

酶在工業過程中的應用要求具有良好的穩定性[6],嗜熱脂肪酶通常在較高溫度下仍能比較穩定,并且大多是從嗜熱細菌中分離出來的,具有催化效率高、冷卻能耗低等優點,可以完成許多高溫反應過程[7],然而天然酶生長緩慢、生長條件苛刻,限制了其產量,直接利用脂肪酶往往不實際,科研工作者利用基因工程、蛋白質工程等方法異源表達重組酶已成為研究熱點,但現有報道中的嗜熱脂肪酶耐受溫度不是太高[8],無法在工業上大范圍應用,因而需要尋找一種更穩定的嗜熱脂肪酶。本實驗室早期的研究集中在嗜熱玫瑰紅球菌ThermomicrobiumroseumDSM 5159,這是1株從美國黃石溫泉篩選出的嗜熱古細菌,適宜生長溫度為70～75 ℃[9],根據其全基因組注釋,預測該古細菌產生一種322個氨基酸組成的脂肪酶,將這段氨基酸序列應用到網站(https://swissmodel.expasy.org)同源建模發現,T.roseumDSM 5159脂肪酶與海洛因酯酶(PDB ID:1lzk.1)相似度為45.19%,因而可能被認為是生產耐熱脂肪酶的良好候選者。

高效異源表達嗜熱脂肪酶,提高生產效率使其應用到工業上具有重要意義。本研究克隆了一個預測的T.roseumDSM 5159liP基因到pTIG質粒中,轉化至大腸桿菌BL21(DE3)中表達,經鎳柱親和層析純化得到純酶,基質輔助激光解析電離串聯飛行時間質譜(matrix-assisted laser desorption ionization time of flight，MALDI-TOF)進一步鑒定表達結果,并考察了熱穩定性、酸堿性、金屬離子、有機溶劑和表面活性劑對重組酶的影響,較全面系統地表征該酶的酶學性質。

1 材料與方法

1.1 質粒和菌株

EscherichiacoliJM109、EscherichiacoliBL21(DE3)、質粒pTIG均為本實驗室保存。

1.2 試劑、培養基和儀器

LB培養基(g/L)：酵母粉5,胰蛋白胨10,NaCl 10,115 ℃滅菌20 min。

主要試劑：PrimerSTAR Max DNA聚合酶、同源重組酶、限制性內切酶Hind Ⅲ、EcoR Ⅰ,TaKaRa公司；對硝基苯酚棕櫚酸酯等系列底物,SIGMA公司；其他試劑均為國產分析純。

儀器：S100D型PCR儀,美國BIO-RAD公司；V-1200分光光度計,上海美普達儀器公司；SCG蛋白純化系統,蘇州賽譜儀器有限公司；MOS-450圓二色光譜儀,法國Bio-Logic公司；NANO DSC差示掃描微量熱儀,美國Waters公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 重組菌的構建及誘導表達

從NCBI下載預測脂肪酶氨基酸序列(ACM04789.1),送生工生物工程(上海)股份有限公司合成基因,在引物上設計載體pTIG同源臂,以上、下游引物GGATCCGGTAAGGAGGAATTCTAAATGTCTGTTTTCGCTCGTCTTG和CTCGAGTGCGGCCGCAAGCTTAAGAGCACGTTGAAGAACA進行PCR擴增liP片段,對獲得的片段采用膠回收后,用同源重組酶將其與載體pTIG連接,得到的連接產物pTIG-liP轉化至E.coliJM109感受態中,提取質粒雙酶切和測序驗證正確后,轉化至E.coliBL21(DE3)表達。將重組菌pTIG-liP/BL21(DE3)、對照菌pTIG/BL21(DE3)分別劃線于氨芐抗性平板上37 ℃倒置培養12 h,挑取單菌落接種于15 mL LB液體培養基中,在37 ℃,200 r/min的條件下培養12 h,以2%體積分數的轉接量轉接至50 mL LB培養基中,培養條件不變,繼續培養至OD600=0.6～0.8,添加終濃度為0.1 mmol/L的異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)誘導表達,在20 ℃,200 r/min條件下,誘導發酵24 h,離心棄上清液收集菌體,用20 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH 8.0)洗滌3次,破碎細胞收集上清液即為粗酶液。

1.3.2 重組脂肪酶純化及SDS-PAGE分析

將粗酶液用1 mL鎳柱純化,收集純化的酶液(Lip),透析去除高濃度咪唑,蛋白濃度的測定采用考馬斯亮藍法,用SDS-PAGE分析檢測。

1.3.3 MALDI-TOF分析

回收10% SDS-PAGE凝膠重組脂肪酶條帶于1.5 mL EP管中,然后對凝膠進行脫色、溶化、消化等預處理[10],用MALDI-TOF儀器分析。

1.3.4 圓二色譜(circular dichroism,CD)分析

通過CD分析估計了各種二級結構的占比,將純酶液(0.1 mg/mL)置于1 mm的比色皿中,在190～250 nm波長處掃描[11],3次測量的數據取平均值。

1.3.5 差示掃描量熱法(differential scanning calorimetry,DSC)分析

通過差示掃描量熱儀測定Lip的變性溫度(Tm),在測定樣品前,先用透析液重復測定3次,以平衡基線。取500 μL Lip放入樣品池中掃描,設置溫度為70～130 ℃,升溫速率為2 ℃/min[10],實驗結果用NanoAnalyze軟件進行分析。

1.3.6 脂肪酶活力測定

參考SHA等[12]的方法略有改動,底物1∶15 mmol/L對硝基苯酚棕櫚酸酯溶于二甲基亞砜中；底物2∶50 mmol/L Tris-HCl、0.55 g/L阿拉伯膠、1.2 g/L脫氧膽酸鈉,pH 8.0；按體積比1∶100混合,現配現用,反應前將混合物置于45 ℃孵育5 min。反應體系：取上述混合物2.4 mL,加入0.1 mL適當稀釋的酶液,于70 ℃準確反應5 min,加入0.1 mL濃度為1 mol/L Na2CO3溶液終止反應,空白對照為不加酶液的緩沖液,于410 nm波長處測定吸光值。酶活力定義：每分鐘產生1 μmol對硝基苯酚所需要的酶量為1個酶活單位(U)。酶活力計算如公式(1)所示：

(1)

式中：V1,反應總體積,mL；ε,摩爾消光系數,mL/mmol；t,反應時間,min。

以上反應均設置3組平行實驗,沒有特殊說明酶活力檢測方法均按此實驗。

1.3.7 重組脂肪酶酶學性質測定

1.3.7.1 最適反應pH及pH穩定性測定

按1.3.6的方法,在pH為5.5～11.0的緩沖液中測定酶活力,將實驗中所測得的最高酶活力記作100%,并計算其他pH值條件下的相對酶活力,確定最適pH值。pH穩定性測定：將適量稀釋的Lip置于pH為5.5～11.0的不同緩沖液中,于4 ℃下,2 h后測定殘留酶活力。各pH緩沖體系分別為：Na2HPO4-NaH2PO4(pH=5.5～7.5)、Tris-HCl(pH=7.5～9.0)、Gly-NaOH(pH=9.0～11.0)。

1.3.7.2 最適反應溫度及溫度穩定性測定

將Lip在40～100 ℃范圍內測定酶活力,以最高酶活力作為100%,計算其他溫度的相對酶活力,確定最適反應溫度。溫度穩定性測定：在0～90 ℃的梯度溫度范圍內孵育12 h后,以未處理酶的酶活力作為100%,測定殘留脂肪酶相對酶活力。

1.3.7.3 有機溶劑對重組脂肪酶的影響

將Lip在不同的有機溶劑V(Lip)∶V(有機溶劑)=1∶1中孵育,以不加有機溶劑的酶活力作為100%,分別于1、12、24 h取樣測定酶活力。有機溶劑包括二甲基甲酰胺、二甲基亞砜、甲醇、乙醇、乙腈、甘油、正己烷、環己烷、異丙醇、甲苯、正丁醇、乙酸乙酯、氯仿和四氫呋喃。

1.3.7.4 金屬離子、表面活性劑和抑制劑對重組脂肪酶的影響

向反應體系中分別加入不同金屬離子(Al3+、K+、Ca2+、Zn2+、Co2+、Mn2+、Mg2+、Fe3+、Cu2+和Ni2+)至終濃度為0.1、1.0、3.0 mmol/L,表面活性劑[十二烷基硫酸鈉(SDS)，曲拉通100，吐溫40，吐溫80]和抑制劑[乙二胺四乙酸(EDTA)，苯甲基磺酰氟(PMSF)，L-半胱氨酸和二硫蘇糖醇(DTT)]至終濃度為0.1、0.5、1.0 mmol/L,以未處理酶的酶活力為對照,測定脂肪酶相對酶活力。

1.3.7.5 底物特異性及動力學研究

選擇不同濃度的底物(對硝基苯酚乙酸酯、對硝基苯酚丁酸酯、對硝基苯酚辛酸酯、對硝基苯酚月桂酸酯和對硝基苯酚棕櫚酸酯),在70 ℃下與Lip反應,測定初始反應速度,利用Origin軟件中的Michaelis-Menten方程進行非線性曲線擬合,得到米氏常數Km和最大反應速率Vm值,并計算kcat和kcat/Km值,確定脂肪酶對不同碳鏈長度底物的特異性。kcat計算如公式(2)所示：

(2)

(3)

式中：kcat,催化常數,s-1；Vm,最大反應速率,μmol/min；[E],蛋白物質的量,μmol；c,蛋白濃度,mg/mL；V,酶液體積,μL；M,蛋白分子質量,Da。

2 結果與分析

2.1 重組脂肪酶的構建、表達和純化

如圖1-a,1-b所示,設計分子伴侶硫氧還蛋白TrxA和脂肪酶共表達,成功構建了重組質粒。SDS-PAGE(圖1-c)分析表明重組蛋白表達量高,純化條帶單一,分子質量大小約為38 kDa,與氨基酸序列計算的理論分子質量36.7 kDa基本一致,首次實現了該脂肪酶可溶性表達。測定粗酶和純酶酶活力發現,純酶的比酶活為3.23 μmol/(min·mg),較之粗酶的0.38 μmol/(min·mg)提高了8.5倍。

a-pTIG-liP質粒圖;b-重組質粒雙酶切鑒定;c-SDS-PAGE分析在b圖中,M-Marker；1-5 727和966 bp；在c圖中,M-Marker;1-空載；2-重組脂肪酶粗酶液；3-純酶

2.2 重組脂肪酶Tm和二級結構分析

如圖2所示,5個肽段匹配得分有4個可信度單獨超過閾值分數,蛋白得分357分,認為質譜結果基本可信,約38 kDa大小的條帶確實是脂肪酶(gi|506402911)。CD檢測結果如圖3所示，并進一步將數據在網站(http://dichroweb.cryst.bbk.ac.uk/html/home.shtml)分析,結果表明重組脂肪酶由56.3% α-螺旋、4.3% β-折疊、19.9% β-轉角和20.3%無規則卷曲組成,α-螺旋結構在增強穩定性方面發揮了重要作用,這與CAO等[13]報道的脂肪酶一致。在Nano-DSC分析中,純酶的Tm和ΔH分別為97.53 ℃和1 637 kJ/mol(圖4),Tm值是蛋白質的解鏈溫度即變性溫度,數值越大越穩定,且遠高于表1已報道的耐熱脂肪酶,表明該酶具有非常優異的熱穩定性。

圖2 重組脂肪酶的MALDI-TOF分析結果

圖3 重組脂肪酶的二級結構分析

圖4 重組脂肪酶熔融溫度(Tm)分析

表1 不同來源脂肪酶的熱穩定性

2.3 重組脂肪酶酶學性質分析

2.3.1 溫度及pH對重組脂肪酶的影響

如圖5-a,5-b所示,最適反應溫度為85 ℃,0～90 ℃孵育12 h后,0～80 ℃的酶活力保留率在80%以上,而由于酶的構象在溫度過高時被破壞[2],90 ℃時僅有40%。酶的最適反應pH為8.5(圖5-c),屬于堿性脂肪酶。在不同pH于4 ℃孵育2 h,酶活力殘留率均在80%以上,pH 8.5～9.5酶活力仍有90%左右,表現出較好的耐堿性(圖5-d)。超嗜熱耐堿脂肪酶鮮有報道,因此該脂肪酶有望在工業上發揮重要作用。

a-最適反應溫度;b-溫度穩定性;c-最適反應pH;d-pH穩定性

2.3.2 有機溶劑對重組脂肪酶的影響

如圖6所示,除氯仿和四氫呋喃對酶活力有強烈抑制外,其他有機溶劑均只有輕微波動,說明重組脂肪酶在大多數有機溶劑中相對穩定。隨著孵育時間的延長,酶活力保留率略有下降,脂肪酶在1 h時對logP值小的有機溶劑耐受能力較強,如：二甲基甲酰胺(121.10%)、二甲基亞砜(110.23%)、甲醇(105.83%)、乙醇(96.77%)、乙腈(105.03%)。可能原因是logP值小的有機溶劑更親水,會降低環境的極性,使酶分子能夠正確折疊[22]。此外,乙酸乙酯顯著抑制酶活力(18.81%),猜測可能是乙酸乙酯與底物競爭性結合脂肪酶,后續以乙酸乙酯為底物,采用氫氧化鈉滴定法[23]進行驗證實驗,脂肪酶對乙酸乙酯表現出較強的水解作用。綜上所述,Lip對有機溶劑具有較強的耐受能力,為其在有機相中實現酯化和酯交換反應的廣泛應用奠定了基礎。

圖6 有機溶劑對重組脂肪酶酶活力的影響

2.3.3 金屬離子、表面活性劑及抑制劑對重組脂肪酶的影響

如圖7-a所示,隨著離子濃度的增加,K+和Ca2+對Lip有激活作用,Mg2+、Mn2+和Ba2+的加入對Lip幾乎沒有影響。高濃度的Cu2+和Fe3+對Lip有明顯的抑制作用,Co2+、Zn2+和Ni2+的存在使Lip的相對活性降低到50%。圖7-b展示了表面活性劑和抑制劑對Lip的影響,陰離子表面活性劑SDS(2.67%)對Lip活性有明顯的抑制作用,SDS破壞了蛋白質分子內和分子間的氫鍵,使酶失活,同樣的現象也發生在熱鏈狀地桿菌的嗜熱脂肪酶中[24]。曲拉通 100(91.77%)對脂肪酶的影響較小,而高濃度的非離子表面活性劑吐溫 80和吐溫 40抑制了脂肪酶的活性,1.0 mmol/L 吐溫 80甚至使酶活力降至39.77%,EDTA、L-半胱氨酸和DTT等抑制劑對其活性影響不大,均在85%以上,1.0 mmol/L PMSF對Lip活性有輕微抑制作用,說明活性位點上存在絲氨酸殘基[22]。所以,該酶不含二硫鍵,也不是金屬依賴型酶,在反應體系中加入適當濃度的金屬離子和表面活性劑可以調節Lip的水解活性。

a-金屬離子;b-抑制劑

2.4 重組脂肪酶的動力學研究

Km表示酶和底物之間的親和能力,Km值越小,親和能力越強,以對硝基苯棕櫚酸酯為底物時,該酶的Km=0.01 mmol/L；以對硝基苯基月桂酸酯為底物時,該酶的Km=0.047 mmol/L；以對硝基苯基丁酸酯為底物時,該酶的Km=9.67 mmol/L,說明Lip對中長鏈底物具有較好的親和力。以對硝基苯酚棕櫚酸酯為底物時,Lip的Km值低于文獻中已報道的黏質沙利菌(0.39 mmol/L)[25]、類芽孢桿菌(0.34 mmol/L)[22]和真菌蛹蟲草(0.162 mmol/L)的脂肪酶[26],表現出更強的親和力。kcat/Km被認為能最全面的衡量酶催化能力的指標,數值越大催化效率越高,以對硝基苯棕櫚酸酯為底物時,該酶的kcat/Km為299.0 L/(s·mmol),比其他底物都大,也比NORO等[27]報道的疏綿狀嗜熱絲孢菌重組脂肪酶高[約2 000 L/(s·mol)]。這一動力學研究證實,Lip不僅底物范圍廣,而且催化效率高。

表2 重組脂肪酶動力學參數

3 結論與討論

本研究克隆并表達了T.roseumDSM 5159的預測脂肪酶基因,對純酶進行了生物化學表征,有助于更好地了解嗜熱細菌脂肪酶的基因和酶學性質。獲得的重組脂肪酶具有較高的產量和催化活力,最適反應溫度85 ℃,Tm為97.53 ℃,比其他大部分嗜熱脂肪酶都高,在80 ℃孵育12 h后仍有80%以上的酶活保留率,最適反應pH為8.5,在8.5～9.5范圍內孵育2 h酶活力在90%以上,具有非常優越的穩定性。該酶對一系列有機溶劑耐受力較強,金屬離子Ca2+和K+對純化的脂肪酶有激活作用,表面活性劑SDS對該酶有強烈的抑制效果,而抑制劑對酶活力沒有明顯影響。脂肪酶對不同底物的動力學參數表明,最適底物是對硝基苯酚棕櫚酸酯,Km為0.01 mmol/L,kcat/Km為299.0 L/(s·mmol),底物范圍廣且對中長鏈底物親和力更高,這與文獻中脂肪酶性質一致[1],但相較于商業脂肪酶,酶活力仍有待提高,后續研究將通過同源建模,針對催化中心周圍氨基酸理性改造,期望獲得高催化效率的耐高溫脂肪酶,使其能夠在非水相催化、洗滌和高溫環境工業等領域得到廣泛應用。