變異軸孔珊瑚(Acropora valida)對(duì)酸化高溫脅迫的轉(zhuǎn)錄組水平反應(yīng)及恢復(fù)潛力分析*

吳 含 肖逸林 柴光俊 宋倩倩 李志勇

變異軸孔珊瑚()對(duì)酸化高溫脅迫的轉(zhuǎn)錄組水平反應(yīng)及恢復(fù)潛力分析*

吳 含 肖逸林 柴光俊 宋倩倩 李志勇①

(上海交通大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院 微生物代謝國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 上海 200240)

采用RNAseq測(cè)序技術(shù)對(duì)比變異軸孔珊瑚()在酸化高溫脅迫及去脅迫條件下的mRNA轉(zhuǎn)錄組。構(gòu)建了12個(gè)cDNA文庫, 共獲得451 789 689個(gè)雙端片段。通過拼接共得到1 056 727個(gè)轉(zhuǎn)錄本, 其中86.5%匹配到珊瑚序列。轉(zhuǎn)錄本的差異表達(dá)分析顯示, 脅迫條件下共6 328個(gè)轉(zhuǎn)錄本發(fā)生了顯著變化, 主要涉及熱休克蛋白、物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、凋亡調(diào)節(jié)和鈣化四個(gè)方面。其中98.1%的差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄本在脅迫去除后都能恢復(fù)到對(duì)照組水平; 結(jié)果表明, 盡管變異軸孔珊瑚在酸化高溫脅迫時(shí)受到很大影響, 但其轉(zhuǎn)錄本表達(dá)在脅迫去除后能恢復(fù)到原來的水平。首次探究酸化高溫雙脅迫去除后變異軸孔珊瑚轉(zhuǎn)錄本表達(dá)水平的恢復(fù)潛力, 對(duì)研究珊瑚如何應(yīng)對(duì)全球氣候變化有一定指導(dǎo)意義。

變異軸孔珊瑚(); 酸化高溫; 轉(zhuǎn)錄活性; 恢復(fù)潛力

大氣二氧化碳濃度升高將會(huì)導(dǎo)致海洋酸化和高溫, 從而加劇珊瑚礁的衰退(Hoegh-Guldberg, 2007, 2010; Pandolfi, 2011)。通過對(duì)珊瑚在海洋酸化和高溫影響下基因表達(dá)模式的研究, 國內(nèi)外研究人員發(fā)現(xiàn)了一些脅迫響應(yīng)特征(DeSalvo, 2008; Rodriguez-Lanetty, 2009; Moya, 2012; Barshis, 2013; Maor-Landaw, 2014); 截至目前, 對(duì)珊瑚在高溫和酸化脅迫下的響應(yīng)機(jī)制(尤其是分子機(jī)制)的研究大多聚焦單一脅迫, 很少關(guān)注雙脅迫同時(shí)存在的情況(Li, 2009; Swan, 2017)。其中Barshis等(2013)對(duì)珊瑚熱脅迫的響應(yīng)做了分析, Moya等(2015)對(duì)珊瑚在二氧化碳引起的酸化引起的轉(zhuǎn)錄本變化進(jìn)行了探索, Kaniewska等(2015)則對(duì)珊瑚在同時(shí)酸化高溫下的響應(yīng)做了研究。海洋酸化和高溫脅迫造成的損傷是否可逆能為脅迫后珊瑚礁的恢復(fù)的研究提供了基礎(chǔ), 對(duì)珊瑚礁的保護(hù)有及其重要的意義。但是, 基于轉(zhuǎn)錄組的珊瑚在脅迫處理后的恢復(fù)潛力研究仍十分匱乏。

作為造礁石珊瑚的重要分支, 鹿角珊瑚科中的變異軸孔珊瑚主要分布在印度洋-太平洋海域的大陸架中部及近海礁。根據(jù)Sakai等(2019)的報(bào)道, 變異軸孔珊瑚更容易因溫度的影響而白化甚至死亡。在此之前, 關(guān)于酸化高溫對(duì)珊瑚影響的研究往往只局限在脅迫下珊瑚的代謝、生物鐘控制及氧化應(yīng)激等方面的變化(Kaniewska, 2015), 卻沒有關(guān)于珊瑚在脅迫去除后轉(zhuǎn)錄水平能否恢復(fù)的研究。本研究從轉(zhuǎn)錄水平對(duì)變異軸孔珊瑚在酸化高溫脅迫下和脅迫去除后珊瑚基因表達(dá)變化進(jìn)行了分析, 探究該珊瑚能否在脅迫去除后恢復(fù)其生理功能。研究結(jié)果既有助于揭示全球氣候變化下珊瑚的響應(yīng)機(jī)制, 也可為因酸化高溫脅迫損害的珊瑚的恢復(fù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

變異軸孔珊瑚于2013年采自南海徐聞珊瑚礁國家自然保護(hù)區(qū)(20°15′29″N, 109°54′28″E)。所有珊瑚采自同一珊瑚礁盤, 采集后立即轉(zhuǎn)入養(yǎng)殖設(shè)備(海水溫度: 26 °C, 鹽度: 33; pH=8.1, 海水流速: 約30 L/h)進(jìn)行適應(yīng)性養(yǎng)殖7 d。之后, 健康珊瑚塊被用作酸化與高溫脅迫實(shí)驗(yàn)。

1.2 模擬實(shí)驗(yàn)及取樣

10塊珊瑚被隨機(jī)分到兩個(gè)不同培養(yǎng)條件(對(duì)照處理, 酸化高溫處理)的培養(yǎng)箱(100 L)。脅迫處理組的溫度和pH在3 d內(nèi)逐漸變化直到最終條件。pH≈7.7對(duì)應(yīng)的二氧化碳濃度符合政府間氣候變化專門委員會(huì)(IPCC)預(yù)測(cè)的2060—2099年達(dá)到的峰值。高溫處理的最終溫度為32 °C是珊瑚白化閾值。對(duì)照維持在約26 °C、pH≈8.1。酸度調(diào)節(jié)通過加入二氧化碳并通過pH控制器調(diào)節(jié), 溫度通過加熱器控制。光照循環(huán)為12 h︰12 h。酸化高溫脅迫處理6 d后取樣作為處理組樣品, 同時(shí)對(duì)照組取樣作為對(duì)照組1; 處理組樣品在酸化與高溫脅迫去除后再培養(yǎng)9 d取樣作為恢復(fù)組樣品, 同時(shí)對(duì)照組取樣作為對(duì)照組2。以上四次取樣均至少三個(gè)生物樣品重復(fù)。取樣時(shí)將珊瑚塊從池中取出, 在4 °C下切成小塊, 在10倍體積的RNA later (中國東勝)中孵育過夜, 之后在–80 °C的條件下保存。

1.3 RNA提取及測(cè)序

珊瑚樣本在液氮中研磨, 采用RNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN)提取珊瑚總RNA。純化后的RNA通過SuperScript First-Strand Synthesis Kit轉(zhuǎn)化為cDNA [共計(jì)12個(gè), 處理組(TAH) 3個(gè), 恢復(fù)組(PAH) 3個(gè), 對(duì)照組1 (C1) 3個(gè), 恢復(fù)組(C2) 3個(gè)]。cDNA樣本使用量子位2.0熒光計(jì)進(jìn)行定量并用0.8%的瓊脂糖凝膠檢測(cè)cDNA的質(zhì)量。總共獲得了12個(gè)cDNA文庫, 測(cè)序在Illumina HiSeq 2500平臺(tái)上進(jìn)行, 使用2×125 bp雙端配置。

1.4 測(cè)序數(shù)據(jù)處理

將12個(gè)文庫的原始數(shù)據(jù)使用FastQC軟件評(píng)估測(cè)序質(zhì)量, 并用Trimmomatic v0.36軟件去除質(zhì)量低的片段及RNA接頭。通過bowtie2-2.2.8軟件與構(gòu)建的rRNA數(shù)據(jù)庫檢測(cè)并去除rRNA序列。其中, rRNA數(shù)據(jù)庫包含了SILVA和RDP的核糖體RNA的序列, 并通過CD-hit軟件以“最小相似度=99%”為標(biāo)準(zhǔn)消除rRNA數(shù)據(jù)庫的序列冗余; 匹配長(zhǎng)度大于30 bp的序列被認(rèn)為是核糖體RNA并去除。清潔后的數(shù)據(jù)使用SOAPdenovo-Trans和KREATION軟件進(jìn)行從頭拼接并產(chǎn)生一個(gè)單獨(dú)contig長(zhǎng)度大于300 bp的參考轉(zhuǎn)錄組。利用bowtie 2-2.2.8軟件將所得文庫與參考轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行比對(duì), 然后導(dǎo)入SAMtools-1.5.1軟件以生成已排序的文件。之后, 通過軟件eXpress-1.3.0對(duì)轉(zhuǎn)錄本表達(dá)豐度進(jìn)行定量, 獲取轉(zhuǎn)錄本表達(dá)計(jì)數(shù)和FPKM值。

1.5 珊瑚轉(zhuǎn)錄本的鑒定和注釋

利用已報(bào)道的刺胞動(dòng)物基因組數(shù)據(jù)(,,,和)建立刺胞動(dòng)物數(shù)據(jù)庫, 并將參考轉(zhuǎn)錄本用blastn與刺胞動(dòng)物基因組數(shù)據(jù)庫比對(duì), 取eValue <1e-10的轉(zhuǎn)錄本為珊瑚轉(zhuǎn)錄本。對(duì)于鑒定到的珊瑚轉(zhuǎn)錄本, 使用blastx對(duì)其進(jìn)行基因本體(GO)和Swiss-Prot蛋白數(shù)據(jù)庫注釋(E-value <1e-5)。

1.6 差異表達(dá)分析及主成分分析

差異表達(dá)分析通過Deseq2軟件完成, 12個(gè)文庫的所有比對(duì)到珊瑚的轉(zhuǎn)錄本通過DEseq2進(jìn)行歸一化, 對(duì)處理組和對(duì)照組1之間、恢復(fù)組與對(duì)照組2之間、恢復(fù)組與處理組之間和兩個(gè)對(duì)照組之間進(jìn)行了差異表達(dá)分析, 以adjusted<0.01和log2(差異表達(dá)倍數(shù)) >±1作為閾值篩選差異轉(zhuǎn)錄本, 差異表達(dá)基因熱圖使用FPKM值進(jìn)行Z-score換算后作出。對(duì)Deseq2歸一化的數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析。

1.7 GO富集分析

使用topGO對(duì)變異軸孔珊瑚的差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行差異表達(dá)分析, 以<0.001作為顯著富集的閾值。

1.8 序列登錄號(hào)

珊瑚宏轉(zhuǎn)錄組原始序列信息已提交NCBI SRA數(shù)據(jù)庫, Bio Project編號(hào)為PRJNA402085。

2 結(jié)果

2.1 珊瑚轉(zhuǎn)錄組構(gòu)建

本研究構(gòu)建了處理組(TAH)、恢復(fù)組(PAH)與兩個(gè)對(duì)照組(C1, C2)的12個(gè)cDNA文庫, 總共產(chǎn)生了451 789 689個(gè)雙端片段。在去除質(zhì)量低的片段、接頭和rRNA后, 總共獲得了231 447 741個(gè)清潔的片段。通過從頭拼接, 總共獲得了1 056 727個(gè)轉(zhuǎn)錄本。通過與刺胞動(dòng)物基因組數(shù)據(jù)庫比對(duì), 總共有913 766個(gè)(86.5%)轉(zhuǎn)錄本能與刺胞動(dòng)物基因組數(shù)據(jù)庫比對(duì)上。利用Swiss-Prot和基因本體(GO)數(shù)據(jù)庫對(duì)珊瑚來源的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行注釋, 得到了96 060個(gè)(10.5%)被Swiss-prot注釋到的轉(zhuǎn)錄本和130 979個(gè)(14.3%)被GO數(shù)據(jù)庫注釋到的轉(zhuǎn)錄本。

2.2 脅迫與恢復(fù)組的珊瑚轉(zhuǎn)錄本表達(dá)模式比較

對(duì)變異軸孔珊瑚()的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行了主成分分析(PCA, 圖1a)。結(jié)果顯示, 珊瑚轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)在四個(gè)組間有明顯的差異。其中, 對(duì)照組1 (C1)與對(duì)照組2 (C2)之間距離最近, 處理組(TAH)距離對(duì)照組1 (C1)最遠(yuǎn); 而恢復(fù)組(PAH)珊瑚轉(zhuǎn)錄本表達(dá)有向兩個(gè)對(duì)照組靠近的趨勢(shì)。為了揭示珊瑚在酸化高溫處理下發(fā)生顯著變化的轉(zhuǎn)錄本, 我們對(duì)不同組別之間(C1 vs C2, TAH vs C1, PAH vs C2, PAH vs TAH)的珊瑚轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了差異表達(dá)分析, 發(fā)現(xiàn)對(duì)照組1與對(duì)照組2之間總共470個(gè)轉(zhuǎn)錄本發(fā)生了差異表達(dá), 這表明在沒有任何脅迫的情況下, 培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)短也會(huì)對(duì)珊瑚的轉(zhuǎn)錄本表達(dá)產(chǎn)生影響。為了去除由培養(yǎng)時(shí)間帶來的轉(zhuǎn)錄本表達(dá)變化, 我們?cè)诜治銎渌M別(TAH vs C1, PAH vs C2, PAH vs TAH)之間的轉(zhuǎn)錄本差異表達(dá)時(shí)將這470個(gè)轉(zhuǎn)錄本排除在外(圖1b)。珊瑚的處理組與對(duì)照組1相比(TAH vs C1)有6 328個(gè)轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)發(fā)生了顯著性變化, 恢復(fù)組與對(duì)照組2 (PAH vs C2)之間有794個(gè)轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)發(fā)生顯著性變化, 而在恢復(fù)組與處理組之間有5 182個(gè)顯著變化的轉(zhuǎn)錄本。同時(shí), 有123個(gè)轉(zhuǎn)錄本同時(shí)在處理組與對(duì)照組1之間和恢復(fù)組與對(duì)照組之間2都表現(xiàn)出顯著性差異; 而處理組差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本中有2 831個(gè)轉(zhuǎn)錄本在恢復(fù)組與處理組之間存在表達(dá)量的顯著差異。

圖1 珊瑚轉(zhuǎn)錄本表達(dá)概況分析

注: a. 轉(zhuǎn)錄本表達(dá)主成分分析; b. 三個(gè)組別之間的差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄本韋恩圖。差異轉(zhuǎn)錄本統(tǒng)計(jì)時(shí)去除了處理對(duì)照與脅迫對(duì)照組之間的差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄本, C1. 對(duì)照組1, TAH. 處理組, C2. 對(duì)照組2, PAH. 恢復(fù)組。vs代表比較, 如TAH vs C1表示處理組與對(duì)照組1的比較

對(duì)處理組和對(duì)照組差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行聚類分析(圖2a), 結(jié)果顯示, 處理組(TAH)的轉(zhuǎn)錄本表達(dá)聚為一枝, 而對(duì)照組1 (C1)、對(duì)照組2 (C2)、恢復(fù)組(PAH)這三個(gè)組的9個(gè)樣本聚為另一枝。在處理組中, 有6 328個(gè)轉(zhuǎn)錄本相對(duì)對(duì)照組差異表達(dá), 這些轉(zhuǎn)錄本在恢復(fù)組中只有123個(gè)還存在顯著的差異表達(dá); 而其他的6 205個(gè)(98.1%)轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)水平相對(duì)于對(duì)照組都已經(jīng)不再表現(xiàn)出顯著差異。

在恢復(fù)組相對(duì)處理組(PAH vs TAH)差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本中, 有2 831個(gè)轉(zhuǎn)錄本同時(shí)也在處理組中表現(xiàn)出相對(duì)于對(duì)照組2 (TAH vs C2)的顯著性變化。對(duì)這2 831個(gè)轉(zhuǎn)錄本在這兩次比較中的差異表達(dá)倍數(shù)進(jìn)行散點(diǎn)圖分析(圖2b)發(fā)現(xiàn)所有點(diǎn)均分布在二、四象限, 這表明在處理組中上調(diào)的轉(zhuǎn)錄本在恢復(fù)處理后表達(dá)下調(diào), 而處理組中下調(diào)的轉(zhuǎn)錄本在恢復(fù)處理后表達(dá)上調(diào)。

在6 205個(gè)表達(dá)能恢復(fù)的轉(zhuǎn)錄本中, 大量編碼熱休克蛋白的轉(zhuǎn)錄本在處理組中表達(dá)上調(diào)(圖3): 包括編碼Endoplasmin (P08110=2)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶BIP (Q90593=2)、Hsp68 (Q97125=3)、Hsp70 (P08106=2, P11503, Q9I8F9, P0DMV8, P12078, P41826)、熱休克同源70、71 kDa蛋白(P08108, Q90473=2)、Hsp-16.1 (P34696)、Hsp-16.2 (P06582=4)及分子伴侶蛋白Djb11 (Q6TUG0)、Djc3 (Q13217=2, Q9R0T3)、Djc19 (Q3ZBN8=2)等蛋白的轉(zhuǎn)錄本; 在恢復(fù)培養(yǎng)9 d之后, 這些熱休克蛋白的表達(dá)與對(duì)照組相比不再表現(xiàn)出顯著差異。

圖2 差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄本分析

注: a. 珊瑚脅迫處理6 d差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)熱圖; b. 2 831個(gè)在處理組與對(duì)照組1比較, 恢復(fù)組與處理組比較都差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本的log2差異表達(dá)倍數(shù)散點(diǎn)圖。X軸: 處理組與對(duì)照組1比較, Y軸: 處理組與恢復(fù)組比較。差異轉(zhuǎn)錄本統(tǒng)計(jì)時(shí)去除了處理對(duì)照與脅迫對(duì)照組之間的差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄本, C1. 對(duì)照組1, TAH. 處理組, C2. 對(duì)照組2, PAH. 恢復(fù)組。vs代表比較, 如TAH vs C1表示處理組與對(duì)照組1的比較。色塊數(shù)值為DEseq2歸一化后的表達(dá)數(shù)所對(duì)應(yīng)的Z-score

細(xì)胞凋亡相關(guān)轉(zhuǎn)錄本在處理組也大量差異表達(dá)(表1), 4個(gè)編碼半胱天冬氨酸蛋白酶3 (caspase 3)的轉(zhuǎn)錄本顯示出表達(dá)上調(diào); 恢復(fù)組與處理組相比, 之前上調(diào)的四個(gè)CASP中有三個(gè)表達(dá)發(fā)現(xiàn)顯著下調(diào), 且最終CASP轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)水平相對(duì)于對(duì)照組都沒有差異表達(dá)。

處理組表達(dá)顯著下調(diào)的轉(zhuǎn)錄本中, 有大量編碼物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的轉(zhuǎn)錄本(圖4)。其中脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的蛋白(NPC1, SLC27)、氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的溶質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)家族蛋白(SLC1, SLC6和SLC7)、碳酸氫根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(SLC4, SLC26)、單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(SLC16)、有機(jī)陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(SLC22, orct)、氨轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、糖轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白(SLC2, SLC5和Tret), 鋅離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(SLC39)都發(fā)生了明顯的下調(diào)。

與此同時(shí), 編碼鈣離子ATP酶(PMCA3=3)的轉(zhuǎn)錄本表達(dá)下調(diào), 且其他的鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白, 包括電容性鈣離子通道鈣離子內(nèi)流蛋白通道(CCE2)、鈉/鈣交換蛋白(NCL, NCL1)和鈉鉀鈣交換蛋白5 (SLC24A5)也表現(xiàn)出表達(dá)下調(diào)(圖5)。碳酸氫根交換相關(guān)的轉(zhuǎn)錄本, 包括2個(gè)編碼陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白SLC4A2和3個(gè)編碼SLC26A6蛋白的轉(zhuǎn)錄本, 也表現(xiàn)出表達(dá)下調(diào)。此外, 還有4個(gè)編碼碳酸酐酶(carbonic anhydrase)的轉(zhuǎn)錄本在脅迫環(huán)境下表達(dá)下調(diào)。這些下調(diào)的轉(zhuǎn)錄本在脅迫去除后表達(dá)水平大都恢復(fù)到原來的水平, 恢復(fù)組表達(dá)聚類也和兩個(gè)對(duì)照組聚在一起。

在恢復(fù)組中, 794個(gè)轉(zhuǎn)錄本相對(duì)對(duì)照組2顯示差異表達(dá), 其中有123個(gè)轉(zhuǎn)錄本在處理組中表現(xiàn)出相對(duì)脅迫對(duì)照組差異表達(dá)。因此, 這123個(gè)轉(zhuǎn)錄本被認(rèn)為是脅迫去除后不能恢復(fù)的。通過GO富集, 這123個(gè)轉(zhuǎn)錄本分別富集到了5個(gè)生物學(xué)過程和5個(gè)分子功能條目。其中, 生物學(xué)過程均與離子跨膜運(yùn)動(dòng)相關(guān); 而富集到的分子功能大多與代謝相關(guān), 如有機(jī)磷酸代謝過程(GO:0019637)、ATP代謝過程(GO:0046034)、嘌呤核糖核苷三磷酸代謝過程(GO:0009205)和三磷酸核糖核苷的代謝過程(GO:0009199)。

3 討論

本研究采用RNAseq技術(shù)對(duì)變異軸孔珊瑚在酸化高溫脅迫及恢復(fù)培養(yǎng)后的轉(zhuǎn)錄本表達(dá)變化進(jìn)行了研究, 以探究珊瑚在脅迫去除后轉(zhuǎn)錄本表達(dá)能否恢復(fù)到原來水平。PCA分析顯示, 在處理組和對(duì)照組1之間的距離最遠(yuǎn); 而相比于處理組, 恢復(fù)組距離對(duì)照組1更近。同時(shí), 我們發(fā)現(xiàn)變異軸孔珊瑚大部分(98.1%)在酸化高溫脅迫處理下發(fā)生差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本在脅迫去除后能恢復(fù)到原來的水平, 且部分轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)模式在恢復(fù)組中與處理組中表現(xiàn)出相反的變化趨勢(shì)。根據(jù)脅迫處理?xiàng)l件下差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄本的豐度進(jìn)行聚類分析, 恢復(fù)組和兩個(gè)對(duì)照組聚為一枝且與處理組分屬不同枝。這些結(jié)果表明, 總體而言, 在酸化與高溫脅迫去除后, 變異軸孔珊瑚的差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本表達(dá)能恢復(fù)到原來的水平的。

圖3 熱休克蛋白表達(dá)熱圖

注: SwissID代表Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫編號(hào), 蛋白質(zhì)名是Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫注釋到的蛋白名稱。色塊紅色表示高表達(dá), 藍(lán)色表示低表達(dá)

表1 脅迫處理下凋亡相關(guān)差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄本在不同組別之間的差異表達(dá)情況(log2差異表達(dá))

Tab.1 Comparison of apoptotic genes that expressed differentially in combined acidification and elevated temperature treatment (log2 differential expression)

注: 差異轉(zhuǎn)錄本統(tǒng)計(jì)時(shí)去除了處理對(duì)照與脅迫對(duì)照組之間的差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄本, C1. 對(duì)照組1, TAH. 處理組, C2. 對(duì)照組2, PAH. 恢復(fù)組。vs代表比較, 如TAH vs C1表示處理組與對(duì)照組1的比較。ns代表沒有顯著變化

3.1 變異軸孔珊瑚熱休克蛋白表達(dá)在脅迫去除后得到恢復(fù)

熱休克蛋白及其伴侶蛋白在蛋白質(zhì)折疊、展開和降解過程中起著至關(guān)重要的作用(S?rensen, 2003), 是珊瑚熱應(yīng)激、高二氧化碳應(yīng)激時(shí)的主要生物標(biāo)志物(Black, 1984; DeSalvo, 2008; Moya, 2015), 其表達(dá)往往隨著脅迫的產(chǎn)生而增高。在酸化高溫處理下, 大量熱休克蛋白表達(dá)上調(diào)(圖3), 表明該珊瑚正在經(jīng)歷脅迫, 并存在脅迫響應(yīng)。在脅迫處理去除后, 這些在酸化高溫脅迫下表達(dá)上調(diào)的熱休克蛋白轉(zhuǎn)錄本不再表現(xiàn)出表達(dá)水平的顯著差異, 表明在脅迫去除之后該珊瑚熱休克蛋白的表達(dá)能恢復(fù)到原來的水平, 預(yù)示著脅迫去除后該珊瑚的整體脅迫響應(yīng)有所緩解。

圖4 編碼物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白的轉(zhuǎn)錄本表達(dá)熱圖

注: SwissID代表Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫編號(hào), 蛋白質(zhì)名是Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫注釋到的蛋白名稱。色塊紅色表示高表達(dá), 藍(lán)色表示低表達(dá)

3.2 變異軸孔珊瑚細(xì)胞凋亡相關(guān)轉(zhuǎn)錄本表達(dá)在脅迫去除后得到恢復(fù)

珊瑚細(xì)胞凋亡引起其共生蟲黃藻釋放被認(rèn)為是珊瑚白化的一個(gè)重要原因(Weis, 2008)。凋亡相關(guān)的半胱天冬氨酸蛋白酶(caspase)在珊瑚白化的相關(guān)研究中多有報(bào)道(Kvitt, 2011; Tchernov, 2011); 在海洋酸化和高溫的作用下, 珊瑚細(xì)胞死亡數(shù)也被發(fā)現(xiàn)有明顯增高(Prada, 2017)。半胱天冬氨酸蛋白酶是一種天門冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶, 在細(xì)胞凋亡中起重要作用, 而caspase 3是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因子(Degterev, 2008)。編碼caspase 3的轉(zhuǎn)錄本在在酸化高溫脅迫處理下表達(dá)上調(diào), 表明珊瑚在脅迫下細(xì)胞正在承受凋亡壓力。在脅迫去除后, 凋亡相關(guān)轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)水平與對(duì)照組沒有顯著差異。編碼caspase 3的轉(zhuǎn)錄本表達(dá)水平的恢復(fù)表明, 變異軸孔珊瑚在經(jīng)歷酸化高溫脅迫后細(xì)胞不再凋亡, 可能預(yù)示著珊瑚在脅迫下的凋亡現(xiàn)象在去除脅迫之后有所緩解。

圖5 珊瑚鈣化相關(guān)轉(zhuǎn)錄本表達(dá)熱圖

注: SwissID代表Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫編號(hào), 蛋白質(zhì)名是Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫注釋到的蛋白名稱。色塊紅色表示高表達(dá), 藍(lán)色表示低表達(dá)

3.3 變異軸孔珊瑚物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)轉(zhuǎn)錄本表達(dá)在脅迫去除后得到恢復(fù)

珊瑚的能量有部分來源于與其共生的蟲黃藻。研究表明蟲黃藻能為其共生刺胞動(dòng)物提供葡萄糖、脂類、丙酮酸和氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì)(Von Holt, 1968; Kellogg, 1983; Burriesci, 2012)。處理組中變異軸孔珊瑚物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)下調(diào), 表明該珊瑚在酸化高溫條件下其物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的功能受到嚴(yán)重抑制。而在恢復(fù)組中, 這些轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)水平與對(duì)照組相比大多不再表現(xiàn)出顯著性差異。同時(shí), 轉(zhuǎn)錄本表達(dá)的聚類分析顯示, 這些轉(zhuǎn)錄本在恢復(fù)組中的表達(dá)情況與在對(duì)照組1、對(duì)照組2中的表達(dá)情況聚為一枝, 而與處理組中的表達(dá)情況有明顯區(qū)分: 這些結(jié)果暗示, 該珊瑚的包括糖轉(zhuǎn)運(yùn)、脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)、單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)和有機(jī)陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)在內(nèi)的物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)功能在去除脅迫后得到一定程度的恢復(fù)。

3.4 變異軸孔珊瑚鈣化相關(guān)轉(zhuǎn)錄本表達(dá)在脅迫去除后得到恢復(fù)

鈣化是造礁石珊瑚形成骨骼的重要過程。在鈣化過程中, 離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是骨骼發(fā)生部位獲取和濃縮鈣離子的必需物質(zhì)(Allemand, 2004)。Zoccola等人對(duì)珊瑚的研究表明, 在珊瑚成骨細(xì)胞中存在的L型鈣離子通道和高離子親和力的鈣離子ATP酶負(fù)責(zé)珊瑚的骨骼形成(Zoccola, 2004; Tambutté, 2011)。在本研究的處理組中, 該珊瑚編碼鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的轉(zhuǎn)錄本PMCA3、NCL、NCL1、SLC24A5的表達(dá)表現(xiàn)出顯著下調(diào): 這些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的減少可能會(huì)導(dǎo)致珊瑚鈣離子無法運(yùn)輸?shù)解}化相關(guān)位置, 從而抑制珊瑚的鈣化功能。

SLC4家族蛋白具有運(yùn)輸碳酸氫/碳酸根根離子的功能(Wang, 2000); 而SLC26A6蛋白則屬于陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族, 具有轉(zhuǎn)運(yùn)碳酸氫根離子的功能。SLC4和SLC26被認(rèn)為刺胞動(dòng)物碳酸氫根離子轉(zhuǎn)運(yùn)重要轉(zhuǎn)錄本, 其中SLC4家族負(fù)責(zé)將碳酸氫根離子運(yùn)輸?shù)解}化位點(diǎn)(Zoccola, 2015)。SLC24和SLC26在該珊瑚的處理組中表達(dá)下調(diào), 預(yù)示著在酸化高溫的共同作用下該珊瑚鈣化過程中碳酸氫根的供給可能正受到抑制。

碳酸酐酶是大部分生物體內(nèi)都存在的用于碳酸氫根離子與二氧化碳相互轉(zhuǎn)化的蛋白酶(Bertucci, 2013), 是珊瑚鈣化過程中碳酸氫根離子的重要來源, 過去很多研究表明它們直接參與了許多種造礁珊瑚的鈣化過程(Tambutté, 2007; Moya, 2008; Chen, 2018)。在本研究的處理組中, 碳酸酐酶轉(zhuǎn)錄本表現(xiàn)出顯著的表達(dá)下調(diào): 這表明在酸化高溫脅迫下, 該珊瑚的碳酸氫根轉(zhuǎn)換功能可能受到了抑制。

在酸化高溫脅迫處理下, 該珊瑚轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)顯示其鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)、碳酸氫根離子轉(zhuǎn)運(yùn)和轉(zhuǎn)化都受到抑制, 由此可認(rèn)為該珊瑚在酸化高溫脅迫下的鈣化功能受到了嚴(yán)重抑制。在酸化高溫脅迫去除后, 上述轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)恢復(fù)到了原來的水平, 暗示該珊瑚的鈣化能力在脅迫去除之后也能得到恢復(fù)。

4 結(jié)論

通過對(duì)變異軸孔珊瑚酸化高溫脅迫前后總體轉(zhuǎn)錄本表達(dá)模式和差異轉(zhuǎn)錄本表達(dá)情況的分析, 發(fā)現(xiàn)在脅迫去除后, 珊瑚98.1%的轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)水平都不再表現(xiàn)出顯著性變化。對(duì)該珊瑚熱休克蛋白、物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞凋亡和鈣化等方面的相關(guān)轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)分析表明, 這些響應(yīng)脅迫或在脅迫中受損的轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)在脅迫去除后能回復(fù)到正常水平。基于此, 本研究認(rèn)為, 在酸化高溫脅迫處理后脅迫去除后繼續(xù)培養(yǎng), 變異軸孔珊瑚的生理功能在轉(zhuǎn)錄本表達(dá)水平與遭受脅迫前差異不顯著。

致謝 感謝南海徐聞珊瑚礁國家自然保護(hù)區(qū)的幫助, 謹(jǐn)致謝忱。

Allemand D, Ferrier-Pagès C, Furla P, 2004. Biomineralisation in reef-building corals: from molecular mechanisms to environmental control. Comptes Rendus Palevol, 3(6/7): 453—467

Barshis D J, Ladner J T, Oliver T A, 2013. Genomic basis for coral resilience to climate change. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 110(4): 1387—1392

Bertucci A, Moya A, Tambutté S, 2013. Carbonic anhydrases in anthozoan corals-A review. Bioorganic & Medicinal Chemistry, 21(6): 1437—1450

Black R E, Bloom L, 1984. Heat shock proteins in(cnidaria, scyphozoa). Journal of Experimental Zoology, 230(2): 303—307

Burriesci M S, Raab T K, Pringle J R, 2012. Evidence that glucose is the major transferred metabolite in dinoflagellate-cnidarian symbiosis. Journal Experimental Biology, 215(19): 3467—3477

Chen S, Gagnon A C, Adkins J F, 2018. Carbonic anhydrase, coral calcification and a new model of stable isotope vital effects. Geochimica et Cosmochimica Acta, 236: 179—197

Degterev A, Yuan J Y, 2008. Expansion and evolution of cell death programmes. Nature Reviews Molecular Cell Biology, 9(5): 378—390

DeSalvo M K, Voolstra C R, Sunagawa S, 2008. Differential gene expression during thermal stress and bleaching in the Caribbean coral. Molecular Ecology, 17(17): 3952—3971

Hoegh-Guldberg O, Bruno J F, 2010. The impact of climate change on the world's marine ecosystems. Science, 328(5985): 1523—1528

Hoegh-Guldberg O, Mumby P J, Hooten A J, 2007. Coral reefs under rapid climate change and ocean acidification. Science, 318(5857): 1737—1742

Kaniewska P, Chan C K K, Kline D, 2015. Transcriptomic changes in coral holobionts provide insights into physiological challenges of future climate and ocean change. PLoS One, 10(10): e0139223

Kellogg R B, Patton J S, 1983. Lipid droplets, medium of energy exchange in the symbiotic anemone: a model coral polyp. Marine Biology, 75(2/3): 137—149

Kvitt H, Rosenfeld H, Zandbank K, 2011. Regulation of apoptotic pathways by(Anthozoa, Pocilloporidae) to survive thermal stress and bleaching. PLoS One, 6(12): e28665

Li S, Yu K F, Shi Q, 2009. Low water temperature tolerance and responding mode of scleractinian corals in Sanya Bay. Chinese Journal of Applied Ecology, 20(9): 2289—2295

Maor-Landaw K, Karako-Lampert S, Ben-Asher H W, 2014. Gene expression profiles during short-term heat stress in the red sea coral. Global Change Biology, 20(10): 3026—3035

Moya A, Huisman L, Ball E E, 2012. Whole transcriptome analysis of the coralreveals complex responses to CO2-driven acidification during the initiation of calcification. Molecular Ecology, 21(10): 2440—2454

Moya A, Huisman L, Foret S, 2015. Rapid acclimation of juvenile corals to CO2-mediated acidification by upregulation of heat shock protein and Bcl-2 genes. Molecular Ecology, 24(2): 438—452

Moya A, Tambutté S, Bertucci A, 2008. Carbonic anhydrase in the scleractinian coral: characterization, localization, and role in biomineralization. Journal of Biological Chemistry, 283(37): 25475—25484

Pandolfi J M, Connolly S R, Marshall D J, 2011. Projecting coral reef futures under global warming and ocean acidification. Science, 333(6041): 418—422

Prada F, Caroselli E, Mengoli S, 2017. Ocean warming and acidification synergistically increase coral mortality. Scientific Reports, 7: 40842

Rodriguez-Lanetty M, Harii S, Hoegh-Guldberg O, 2009. Early molecular responses of coral larvae to hyperthermal stress. Molecular Ecology, 18(24): 5101—5114

Sakai K, Singh T, Iguchi A, 2019. Bleaching and post-bleaching mortality ofcorals on a heat-susceptible reef in 2016. Peer J, 7: e8138

S?rensen J G, Kristensen T N, Loeschcke V, 2003. The evolutionary and ecological role of heat shock proteins. Ecology Letters, 6(11): 1025—1037

Swan H B, Deschaseaux E S M, Jones G B, 2017. The relative abundance of dimethylsulfoniopropionate (DMSP) among other zwitterions in branching coral at Heron Island, southern Great Barrier Reef. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 409(18): 4409—4423

Tambutté S, Holcomb M, Ferrier-Pagès C, 2011. Coral biomineralization: From the gene to the environment. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology, 408(1/2): 58—78

Tambutté S, Tambutté E, Zoccola D, 2007. Characterization and role of carbonic anhydrase in the calcification process of the azooxanthellate coral. Marine Biology, 151(1): 71—83

Tchernov D, Kvitt H, Haramaty L, 2011. Apoptosis and the selective survival of host animals following thermal bleaching in zooxanthellate corals. Proceedings of the National Academy Sciences of the United States of America, 108(24): 9905—9909

Von Holt C, Von Holt M, 1968. The secretion of organic compounds by zooxanthellae isolated from various types of. Comparative Biochemistry and Physiology, 24(1): 83—92

Wang C Z, Yano H, Nagashima K, 2000. The Na+-driven Cl-/HCO3-exchanger Cloning, tissue distribution, and functional characterization. Journal of Biological Chemistry, 275(45): 35486—35490

Weis V M, 2008. Cellular mechanisms of cnidarian bleaching: stress causes the collapse of symbiosis. Journal of Experimental Biology, 211(19): 3059—3066

Zoccola D, Ganot P, Bertucci A, 2015. Bicarbonate transporters in corals point towards a key step in the evolution of cnidarian calcification. Scientific Reports, 5: 9983

Zoccola D, Tambutté E, Kulhanek E, 2004. Molecular cloning and localization of a PMCA P-type calcium ATPase from the coral. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes, 1663(1/2): 117—126

TRANSCRIPTOMIC RESPONSE AND THE RECOVERY POTENTIAL OFTO ACIDIC-THERMAL STRESS

WU Han, XIAO Yi-Lin, CHAI Guang-Jun, SONG Qian-Qian, LI Zhi-Yong

(State Key Laboratory of Microbial Metabolism, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200240, China)

RNAseq sequencing technology was performed to compare the mRNA expression ofunder acidic-thermal stress and after the stress is lifted. Twelve cDNA libraries were constructed, and a total of 451 789 689 double-ended fragments were obtained. A total of 1 056 727 contigs were obtained after de novo assembling. Through differential expression analysis of thecontigs, it was found that a total of 6 328 contigs were significantly changed under stress conditions, which include contigs encoding heat shock proteins, substance transporters, apoptosis, and calcification related proteins; and 98.1% of the contigs were recovered after stress release.was obviously affected by acidification and high temperature stress, but its gene expression could be recovered to original level after stress removal. This study is the first to explore the potential for restoration of the transcript expression level of the corals under and after dual acidic-thermal stress, and has certain guiding significance for studying how corals respond to global climate change.

; acidic-thermal stress; RNAseq; recovery potential

* 國家重大科學(xué)研究計(jì)劃資助項(xiàng)目, 2013CB956100號(hào)。吳 含, 碩士研究生, E-mail: wuhan19@sjtu.edu.cn

李志勇, 博士生導(dǎo)師, 教授, E-mail: zyli@sjtu.edu.cn

2021-01-21,

2021-03-25

Q142; Q789; X174

10.11693/hyhz20210100019