白酒固態(tài)雙邊發(fā)酵糖化機(jī)理及其對(duì)發(fā)酵過(guò)程的影響

高銀濤,何璇,余博文,蔡叢菊,陳建新*,丁重陽(yáng)*

1(糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué)),江蘇 無(wú)錫,214122)2(江蘇泰州梅蘭春酒廠有限公司,江蘇 泰州,225300)

中國(guó)白酒是一種在固態(tài)條件下以谷物為原料、酒曲為糖化發(fā)酵劑,采用邊糖化邊發(fā)酵的雙邊發(fā)酵工藝生產(chǎn)的蒸餾酒[1]。由于我國(guó)現(xiàn)代的固態(tài)發(fā)酵技術(shù)起步較晚,所以對(duì)白酒雙邊發(fā)酵過(guò)程的研究較少,就糖化來(lái)說(shuō),國(guó)內(nèi)大部分白酒研究只是聚焦于對(duì)大曲和酒醅中的酶活力和糖化產(chǎn)物的提取和測(cè)定上,未對(duì)雙邊發(fā)酵過(guò)程提出較為精確的控制要求和方法[2-4]。

我國(guó)傳統(tǒng)白酒一直沿用窖池固態(tài)發(fā)酵法,糖化發(fā)酵過(guò)程受到糧食原料的糊化程度、發(fā)酵溫度、酸和酒精等多方面的影響[5]。谷物原糧的糊化是微生物能夠有效利用的關(guān)鍵步驟,蒸煮工藝條件的確定和優(yōu)化對(duì)于后續(xù)的糖化過(guò)程具有重大影響[6]；確定原料糊化率、溫度、酸和酒精等各種因素對(duì)糖化速率的影響,確定對(duì)白酒發(fā)酵的控制方法,對(duì)制曲生產(chǎn)和釀酒生產(chǎn)具有極大的理論和實(shí)踐意義,對(duì)于醋、醬油等固態(tài)發(fā)酵也有一定的借鑒意義[7-9]。本文探究了糊化率、溫度、酸和酒精等因素對(duì)糖化速率的影響和控制方法,不同酒醅初始糖化酶活力和最終的酵母產(chǎn)酒差異,為精確控制白酒糖化過(guò)程提供參考依據(jù)和思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

糧食原料、糠殼,江蘇泰州梅蘭春酒廠有限公司；糖化酶,江蘇銳陽(yáng)生物科技有限公司；釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae),安琪酵母股份有限公司；氨芐青霉素鈉,生工生物工程(上海)股份有限公司；鹽酸、可溶性淀粉、磷酸氫二鈉、檸檬酸、3,5-二硝基水楊酸、酵母膏、葡萄糖等試劑(分析純),國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SHP-250 生化培養(yǎng)箱,上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；UVmini-1240 紫外分光光度計(jì),日本島津公司；PB2002-N 電子天平,Mettler Toledo 公司；Freezone 6 plus真空冷凍干燥機(jī),美國(guó)Labconco公司；Quanta 200 掃描電子顯微鏡,Fei公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制參考文獻(xiàn)[10]。通過(guò)數(shù)據(jù)分析,得到回歸方程y=0.549 2x-0.033 7(R2=0.999 4,x為葡萄糖質(zhì)量濃度；y為吸光度值)。

1.3.2 還原糖測(cè)定

稱取待測(cè)樣品10 g,加入100 mL去離子水,于室溫下攪拌30 min,用濾紙過(guò)濾得到待測(cè)液,用DNS法對(duì)待測(cè)液進(jìn)行還原糖測(cè)定[11-12]。

1.3.3 不同條件對(duì)糖化速率的影響

研究糊化率、溫度、酸和酒精對(duì)糧食糖化速率的影響,主要通過(guò)加塞玻璃瓶模擬窖池糧食糖化發(fā)酵固態(tài)條件從而進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。采用糊化率55%蒸煮工藝得到的原料,發(fā)酵溫度30 ℃,酶用量120 U/g,乳酸含量0.04 mL/g,酒精含量0 mL/g。在其他條件不變下,分別改變:原料糊化率(50%、55%、60%),溫度(20、30、40、50、60 ℃),乳酸增量(0、0.02、0.04、0.06 mL/g),酒精(0、0.05、0.1、0.15、0.2 mL/g)。糖化發(fā)酵4 h,測(cè)定還原糖量,計(jì)算糖化速率。上述條件覆蓋正常白酒發(fā)酵的酒醅的溫度、酸度和酒精含量范圍。

1.3.4 糧食原料蒸煮工藝

傳統(tǒng)釀酒原料堆積入窖前的蒸煮工藝依次是熱水潤(rùn)糧,潤(rùn)糧一段時(shí)間后拌糠殼以增加糧食的疏松度和透氣性,之后蒸糧,最后進(jìn)行拌曲拌醅入池發(fā)酵[13]。根據(jù)糧食蒸煮的影響因素,選取了潤(rùn)糧水量(50%、70%、90%)、潤(rùn)糧時(shí)間(120、150、180 min)、蒸糧時(shí)間(30、40、50 min)以及潤(rùn)糧水溫(60、80、100 ℃)4個(gè)因素進(jìn)行4因素3水平正交試驗(yàn),同時(shí)結(jié)合糊化率進(jìn)行判別。糊化率測(cè)定方法參考馮興垚[14]方法確定。

1.3.5 實(shí)驗(yàn)室模擬糖化發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

本實(shí)驗(yàn)主要探究的是糖化速率對(duì)酵母發(fā)酵白酒的影響,為了降低無(wú)關(guān)因素的影響,在發(fā)酵前只添加糖化酶和釀酒酵母。具體操作：以加塞玻璃瓶模擬窖池,將經(jīng)過(guò)蒸煮的原料每100 g拌入10 mL不同濃度糖化酶得到不同的初始酶活力原料(15、30、60、120、180 U/g)和10 mL活化酵母液(2×107CFU/mL),進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。

1.3.6 掃描電子顯微鏡微觀分析

采用掃描電子顯微鏡對(duì)糧食碎粒糖化面進(jìn)行微觀分析,選取原始高粱碎粒、潤(rùn)糧后高粱顆粒、蒸煮后高粱碎粒和發(fā)酵一段時(shí)間高粱碎粒。將樣品放置-70 ℃冰箱進(jìn)行冷凍處理24 h,取適量入50 mL離心管中用真空冷凍干燥機(jī)進(jìn)行干燥處理,最后取樣品進(jìn)行掃描電子顯微鏡拍照,進(jìn)行微觀結(jié)構(gòu)觀察分析[15-17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同因素對(duì)糖化速率的影響

2.1.1 糊化率對(duì)糖化速率的影響

由圖1可以看出,糊化率不同,糧食原料的糖化速率不同,并且糖化速率隨著糊化率上升而逐漸上升。原因可能是隨著糊化率的增加,糖化酶底物隨之增加,在酶充足的條件下,糖化速率也隨之增加[18]。在實(shí)際生產(chǎn)中,可以通過(guò)控制糧食原料的蒸煮工藝進(jìn)而改變白酒原料的糊化程度,來(lái)控制原料的糖化速率。

圖1 糊化率對(duì)糖化速率的影響

2.1.2 糧食蒸煮工藝的優(yōu)化

通過(guò)正交試驗(yàn),探究了潤(rùn)糧用水量、潤(rùn)糧時(shí)間、潤(rùn)糧溫度和蒸糧時(shí)間對(duì)糧食糊化率的影響,其結(jié)果如表1所示。最佳工藝參數(shù)為：潤(rùn)糧水量90%、潤(rùn)糧時(shí)間180 min、蒸糧時(shí)間40 min、潤(rùn)糧溫度60 ℃。在此條件下糊化率最高,可達(dá)61.63%,相同工藝重復(fù)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)糊化率達(dá)60.78%,誤差較小。在幾種影響因素中,蒸糧時(shí)間對(duì)糧食原料糊化影響最大,極差為6.263。但在實(shí)際生產(chǎn)中,蒸煮工藝還需要結(jié)合感官評(píng)價(jià),不能一味只顧糊化率,導(dǎo)致發(fā)酵原料過(guò)于發(fā)黏。

表1 糧食蒸煮工藝正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.3 溫度對(duì)糖化速率的影響

由圖2可以看出,在20～50 ℃,酶反應(yīng)速率隨著溫度上升而逐漸上升,50 ℃以后,酶反應(yīng)速率急劇下降。原因可能有2個(gè)方面,一方面前期隨著溫度的升高,反應(yīng)物能量加劇,有效碰撞增加,酶促反應(yīng)速率增加,糧食糖化速率加快;另一方面,糖化酶作為一種蛋白質(zhì),溫度的升高會(huì)引起酶蛋白質(zhì)的變性,導(dǎo)致酶促反應(yīng)速率下降[19]。結(jié)合日常發(fā)酵和酶學(xué)特性判斷,當(dāng)保持糖化反應(yīng)溫度為40～50 ℃時(shí),糧食糖化速率最快,在具體生產(chǎn)中可以結(jié)合溫控設(shè)備對(duì)酒醅發(fā)酵進(jìn)行溫度實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)并采取適宜手段進(jìn)行控溫發(fā)酵。

圖2 溫度對(duì)糖化速率的影響

2.1.4 乳酸對(duì)糖化速率的影響

由圖3-a可以看出,在潤(rùn)糧時(shí)加一定量乳酸,在一定范圍內(nèi)可以促進(jìn)原料的糊化,這是因?yàn)樗岬脑黾佑欣诘矸劢到鉃樾》肿覽20],但隨著酸的增加,促進(jìn)原料糊化效果降低,同時(shí)還會(huì)導(dǎo)致原料發(fā)黏,不利于后續(xù)的發(fā)酵。由圖3-b得知,在蒸煮后添加不同含量的乳酸,糖化速率隨著乳酸含量上升而逐漸下降。原因可能是隨著乳酸含量的增加,酶活性部位基團(tuán)的解離狀態(tài)不利于酶與底物的結(jié)合,酶活力相應(yīng)降低,同時(shí)添加乳酸會(huì)使pH降低,對(duì)酶的構(gòu)象產(chǎn)生影響,從而使酶變性失活[21]。

a-乳酸對(duì)糊化率的影響；b-乳酸對(duì)糖化速率的影響

2.1.5 酒精對(duì)糖化速率的影響

由圖4可以看出,糖化速率隨著酒精含量上升而緩慢下降,當(dāng)酒精含量達(dá)到一定含量,隨著酒精含量上升,糖化速率變化趨于平緩,從整體趨勢(shì)來(lái)看,酒精對(duì)糖化速率影響不大。原因可能是酒精不參與糖化反應(yīng),所以對(duì)糖化反應(yīng)速率影響較小,但同時(shí)另一方面酒精的存在會(huì)對(duì)酶的構(gòu)象產(chǎn)生影響,從而使酶變性失活。

圖4 酒精對(duì)糖化速率的影響

2.2 模擬糖化發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

在糖化速率影響因素研究過(guò)程中,發(fā)現(xiàn)溫度、酸等因素主要是通過(guò)影響酶活力,進(jìn)而影響糖化速率。在此基礎(chǔ)上,根據(jù)控制初始酶活力,結(jié)合酒精度測(cè)定,對(duì)糧食原料進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn),結(jié)果如圖5所示。

圖5 初始酶活力對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酒精的影響

由圖5可以看出,發(fā)酵原料初始酶活力高于120 U/g,即發(fā)酵原料的初始酶活力相對(duì)較高情況下,最后酒精產(chǎn)量變化不大；當(dāng)發(fā)酵原料初始酶活力低于120 U/g,即發(fā)酵原料的初始酶活力相對(duì)較低的情況下,初始酶活力與酒精的最終產(chǎn)量存在顯著相關(guān)。分析原因可能是因?yàn)榘l(fā)酵前期底物充足,在發(fā)酵原料的初始酶活力較低階段,這時(shí)的糖化速率主要取決于初始酶活力,進(jìn)而造成后續(xù)的發(fā)酵產(chǎn)酒差異；到了后期,因?yàn)榻湍复罅克劳龊桶l(fā)酵底物的減少,導(dǎo)致最終產(chǎn)酒存在差異。同時(shí)由圖5中可以看出,在發(fā)酵前期,酒精快速生成,酒精逐漸積累,隨著時(shí)間的延長(zhǎng),在發(fā)酵4 d之后,酒精含量不再顯著增長(zhǎng),結(jié)合圖6分析可知,這是因?yàn)樵诎l(fā)酵過(guò)程中,酵母數(shù)量在4 d左右急劇減少所致,這與高大禹等[22]的白酒發(fā)酵酵母數(shù)量研究結(jié)果相符,還可能的原因是隨著糊精等糖化酶底物逐漸減少造成了糖化發(fā)酵基本停滯。

由圖6-a可以看出,隨著發(fā)酵的進(jìn)行,糧食原料的淀粉含量逐漸降低,與產(chǎn)酒精趨勢(shì)基本相符。由圖6-b可得還原糖含量呈現(xiàn)先減少,后增加的趨勢(shì),初始酶活力越高,該趨勢(shì)越顯著,結(jié)合圖6-c和圖6-d分析發(fā)現(xiàn)，這是因?yàn)樵诎l(fā)酵過(guò)程中酵母數(shù)量逐漸降低,而酶活力基本不變,進(jìn)而導(dǎo)致初始酶活力的情況還原糖會(huì)呈現(xiàn)先減少后增加的變化趨勢(shì)。在實(shí)際生產(chǎn)中,可以通過(guò)控制大曲的產(chǎn)糖化酶菌株的比例、拌曲發(fā)酵時(shí)的用曲比例以及改變堆積時(shí)間來(lái)控制入窖前酒醅的初始糖化酶活力,進(jìn)而達(dá)到控制白酒發(fā)酵的目的。

a-淀粉；b-還原糖；c-糖化酶活力；d-酵母數(shù)量

2.3 高粱的微觀結(jié)構(gòu)觀察

由圖7所示,在不同條件下高粱碎粒淀粉的微觀結(jié)構(gòu)顯著不同。如圖7-a所示,潤(rùn)糧前高粱淀粉顆粒立體結(jié)構(gòu)比較完整,呈現(xiàn)橢圓粒狀,表面比較光滑。如圖7-b所示,經(jīng)過(guò)一段時(shí)間潤(rùn)糧,淀粉顆粒吸水膨大,從圖7-b-3與圖7-a-3對(duì)比來(lái)看,圖7-b-3所示的淀粉顆粒相對(duì)更大,立體結(jié)構(gòu)呈圓球狀,淀粉顆粒表面也相對(duì)光滑。在經(jīng)歷蒸煮過(guò)程中,膨大的淀粉顆粒因?yàn)槲锢碜饔煤崎_(kāi),原本結(jié)構(gòu)被破壞,形成不規(guī)則的蜂窩狀立體結(jié)構(gòu)如圖7-c-2所示,此時(shí)一些淀粉變成容易被糖化酶利用的糊精等物質(zhì)。經(jīng)過(guò)糖化酶的分解作用,容易被分解的物質(zhì)被分解,形成如圖7-d-2所示的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),在圖7-d-3可以看到上面由一些明顯可見(jiàn)的橢球形顆粒,根據(jù)查閱資料發(fā)現(xiàn)酵母菌的常規(guī)大小為1～10 μm[23],根據(jù)結(jié)構(gòu)和大小合理推測(cè)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)上的橢球形小顆粒為發(fā)酵前添加的酵母菌。

a-未處理高粱；b-潤(rùn)糧后高粱；c-蒸煮后高粱；d-發(fā)酵后高粱

3 結(jié)論與討論

控制原料的蒸煮工藝可以間接控制白酒后續(xù)的糖化發(fā)酵。通過(guò)正交試驗(yàn),在優(yōu)化后的工藝參數(shù)下糊化率可達(dá)61%,在影響白酒原料蒸煮工藝的條件中,蒸煮時(shí)間對(duì)糊化率影響最大。實(shí)際生產(chǎn)中蒸煮工藝要結(jié)合感官評(píng)價(jià),不能一味追求糊化率的提高而造成糧食原料蒸煮過(guò)后過(guò)于發(fā)黏。

此外通過(guò)對(duì)糖化速率的影響因素研究發(fā)現(xiàn),溫度、酸等因素主要是通過(guò)影響酶活力對(duì)糖化速率產(chǎn)生影響。本實(shí)驗(yàn)研究的糖化酶適宜溫度為40～50 ℃,酸對(duì)糖化的影響有兩方面,一方面適量的酸能夠促進(jìn)原料糊化,另一方面酸會(huì)導(dǎo)致糖化酶活力降低影響糖化速率。當(dāng)發(fā)酵原料初始酶活力低于120 U/g,發(fā)酵原料的初始酶活力與酒精的最后產(chǎn)量存在顯著相關(guān)。在實(shí)際生產(chǎn)中,可以通過(guò)控溫發(fā)酵和選育耐酸性菌株來(lái)提高糖化速率和發(fā)酵出酒率,還可以通過(guò)控制大曲中的產(chǎn)糖化酶菌株的比例、拌曲發(fā)酵時(shí)的用曲比例以及改變酒醅堆積時(shí)間來(lái)控制入窖前酒醅的初始糖化酶活力,進(jìn)而達(dá)到控制白酒雙邊發(fā)酵的目的。