南瓜嫁接提高冬瓜枯萎病抗性的化感機(jī)制

袁飛 劉子凡 廖道龍 高瞻 曹鑫鑫

摘 要：以自接冬瓜（SGwg）、自接南瓜（SGp）及南瓜嫁接冬瓜（Gwg）為材料，采用苗期接種法對(duì)植株抗病性進(jìn)行比較，并通過平板試驗(yàn)分析其根系分泌物對(duì)冬瓜枯萎病菌菌絲生長(zhǎng)的化感效應(yīng)，同時(shí)采用GC-MS分析鑒定根系分泌物的成分和相對(duì)含量，為通過南瓜嫁接防治冬瓜枯萎病及開發(fā)植物源新農(nóng)藥提供理論依據(jù)。結(jié)果表明：（1）SGwg易感冬瓜枯萎病，Gwg與SGp高抗冬瓜枯萎病，且大田試驗(yàn)中Gwg的單瓜質(zhì)量和小區(qū)產(chǎn)量明顯高于SGwg;（2）Gwg和SGp根系分泌物對(duì)冬瓜枯萎病菌具有化感抑制作用，而SGwg根系分泌物對(duì)其具有化感促進(jìn)作用;Gwg與SGwg的化感效果存在顯著差異，而Gwg與SGp的化感效果差異不顯著;（3）隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)，Gwg根系分泌物的化感抑制效果明顯增強(qiáng)，SGp的化感抑制效果變化不明顯，SGwg的化感促進(jìn)效果呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢(shì);（4）嫁接植株根系分泌物的組成比自接南瓜和自接冬瓜均要豐富，且相對(duì)含量也與自接南瓜和自接冬瓜存在顯著差異。綜上所述，南瓜嫁接提高冬瓜枯萎病抗性的化感機(jī)制是嫁接改變了根系分泌物組成且含有抑制冬瓜枯萎病病菌菌絲生長(zhǎng)的成分。

關(guān)鍵詞：冬瓜;嫁接;枯萎病病菌;根系分泌物;分離鑒定

中圖分類號(hào)：S642.3+S642.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1673-2871（2021）05-026-04

Allelopathymechanism of grafting with pumpkin rootstock on improving resistance to Fusarium wilt in wax gourd

YUAN Fei1， LIU Zifan1， LIAO Daolong2， GAO Zhan1， CAO Xinxin1

（1. College of Tropical Crops， Hainan University， Haikou 570228， Hainan， China; 2. Institute of Vegetables， Hainan Academy of Agricultural Sciences， Haikou 571100， Hainan， China）

Abstract： With self-grafted pumpkin（SGp）， self-grafted wax gourd（SGwg） and grafted wax gourd（Gwg）as materials， the growth of the Fusarium oxysporum of wax gourd were measured by using mycelial growth rate method， the disease resistance were identified by using the seedling inoculation method， and the chemical element of SGp， SGwg and Gwg root exudates were anlysized by GC-MS. The results showed that： （1）SGpand Gwg are highly resistant to Fusarium wilt， while SGwg is highly susceptible. Single fruit weight and the yield of Gwg were significantly higher than that of SGwg. （2）Root exudates（RE） of SGp and Gwg could inhibit the growth of the F. oxysporum， while the RE of SGwg could promote the growth. The allelopathy of Gwg has significantly difference with that of the SGwg， but it has not significantly difference with that of SGp. （3）With the extension of treatment time， the inhibition effect of RE from Gwg was significantly enhanced， but the inhibition effect of RE from SGp did not decline， and the promotion effect of RE from SGwg has a decline trend gradually. （4）RE in Gw have more divers chemical elements than that in SGpand SGwg， and there are remarkable differences of RE component among the SGp， SGwg and Gwg.In conclusion， the allelopathy mechanism of Gwg with highly resistant to Fusarium wilt was the variation of RE component in grafted plants which could inhibit the mycelial growth of F. oxysporum.

Key words： Grafted; Wax gourd; Fusarium oxysporum; Root exudate; Extraction and identification

冬瓜（Benincasa hispida （Thunb） Cogn.）是葫蘆科冬瓜屬一年生蔓性草本植物，是一種營(yíng)養(yǎng)豐富的食療保健蔬菜[1]。海南是我國(guó)重要的冬瓜生產(chǎn)和供應(yīng)基地，2018年冬瓜種植面積高達(dá)7006 hm2[2]。隨著冬季異常天氣發(fā)生頻率的加大，全國(guó)對(duì)海南冬季瓜的需求量會(huì)越來越大。在土地有限的現(xiàn)實(shí)背景下，瓜農(nóng)常選擇連作種植，導(dǎo)致冬瓜枯萎病發(fā)生越來越嚴(yán)重，發(fā)病率一般為50%～80%。

冬瓜枯萎病是由尖孢鐮刀菌引起的維管束病害，尖孢鐮刀菌可以產(chǎn)生厚垣孢子，長(zhǎng)時(shí)間存在于土壤中并在其中越冬，抵抗各種不良環(huán)境，繼而侵染植物。植物病害的發(fā)生與化感作用密切相關(guān)[3]。根系分泌物是化感物質(zhì)的重要產(chǎn)生源[4]，直接影響著土壤中病菌孢子的積累速率[5]。嫁接可以直接影響作物根系的生長(zhǎng)狀況，生產(chǎn)中瓜農(nóng)也常采用嫁接的方法來提高植株對(duì)枯萎病的抗性，但前提是有相應(yīng)的高抗砧木材料。前人研究表明，南瓜對(duì)瓜類枯萎病具有免疫性[6]，但采用南瓜砧木嫁接冬瓜的抗病性變化及其化感機(jī)制仍不清楚。前人只在嫁接辣椒[7]、嫁接西瓜[8]、嫁接茄子[9-10]方面有所研究。為此，筆者采用海砧1號(hào)南瓜為砧木，以三水黑皮冬瓜為接穗，選用苗期接種法對(duì)植株抗病性進(jìn)行比較，并通過平板試驗(yàn)分析植株根系分泌物對(duì)冬瓜枯萎病菌菌絲生長(zhǎng)的化感效果，同時(shí)采用GC-MS分析鑒定其成分與相對(duì)含量，為通過嫁接防治冬瓜枯萎病及開發(fā)植物源新農(nóng)藥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

冬瓜品種為三水黑皮冬瓜，砧木為海砧1號(hào)南瓜，均由海南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所提供。在海南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜所育苗基地育苗，嫁接獲得冬瓜/南瓜（用Gwg表示）、冬瓜/冬瓜（用SGwg表示）和南瓜/南瓜（用SGp表示）幼苗。

枯萎病菌種為冬瓜枯萎病病原菌尖鐮孢菌尖鐮孢冬瓜專化型（Fusarium oxysporum Schl. f. sp. benincasae）生理小種 1 號(hào)，由廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所提供。采用PDA培養(yǎng)基（新鮮馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂18 g，去離子水1000 mL）在28 ℃恒溫培養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 嫁接冬瓜抗病性比較試驗(yàn) 試驗(yàn)于2019年11月在海南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院永發(fā)基地進(jìn)行。采用苗期人工接種法對(duì)SGwg、SGp和Gwg植株進(jìn)行枯萎病抗性鑒定[11]。每份材料接種30株，15 d檢查發(fā)病情況，計(jì)算病情指數(shù)，參考郭堂勛等[12]的病情等級(jí)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分級(jí)。

1.2.2 嫁接冬瓜產(chǎn)量比較試驗(yàn) 試驗(yàn)設(shè)在海南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院永發(fā)基地。2019年12月10日將SGwg和Gwg幼苗移栽于大田中，行株距1.50 m×0.75 m;每小區(qū)種植30株，3次重復(fù)，完全隨機(jī)排列。單蔓整枝，每株留1個(gè)瓜。于采收期測(cè)定Gwg與SGwg處理小區(qū)的所有冬瓜的質(zhì)量，統(tǒng)計(jì)每小區(qū)冬瓜個(gè)數(shù)，計(jì)算出單瓜質(zhì)量。

1.2.3 根系分泌物枯萎病病菌化感試驗(yàn) （1）根系分泌物制備：2019年12月取生長(zhǎng)基本一致、3葉1心期的SGwg、SGp和Gwg幼苗，清洗根系，用海綿包裹固定在泡沫板進(jìn)行液體培養(yǎng)，參考王偉等[13]的營(yíng)養(yǎng)液配方，營(yíng)養(yǎng)液大量元素的配方為：54.27 g·L-1 NH4NO3、17.69 g·L-1 KH2PO4、40.25 g·L-1 K2SO4、42.29 g·L-1 CaCl2、45.10 g·L-1 MgSO4·7H2O。將培養(yǎng)15 d后的植株根系分泌物用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至20 mg·mL-1（每mL溶液中含20 mg 根系所產(chǎn)生的分泌物），4 ℃冰箱保存?zhèn)溆肹4]。（2）菌絲生長(zhǎng)平板試驗(yàn)：取SGwg、SGp和Gwg的根系分泌物及其土壤浸提液，經(jīng)0.22 μm的無菌過濾器過濾后，加入到PDA平板中，每皿加入5 mL。再用打孔器取直徑為6 mm菌餅使菌絲朝下接入到PDA平板中央，28 ℃培養(yǎng)，3次重復(fù)，以加無菌水的平板為對(duì)照（CK）。3 d后測(cè)量菌落直徑，每天1次，直到菌絲快長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿為止，按下式計(jì)算化感效果[14]：

化感效果/%=[處理菌落直徑-對(duì)照菌落直徑對(duì)照菌落直徑-0.60]×100。

1.2.4 根系分泌物成分與相對(duì)含量檢測(cè) 取部分根系分泌物用85%的H3PO4調(diào)節(jié)pH 至2左右。放于-20 ℃冰箱，將收集的根系分泌物液體完全冰凍后，使用凍干濃縮儀低溫干燥至粉末狀。將其送至江蘇三黍生物科技有限公司進(jìn)行GC-MS分析鑒定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2016和DPS 7.05軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，用鄧肯氏新復(fù)極差法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 冬瓜枯萎病病情指數(shù)的差異

從表1可以發(fā)現(xiàn)，南瓜及其為砧木嫁接的冬瓜枯萎病病情指數(shù)分別為0.00%和5.00%，均表現(xiàn)為高抗，而自接冬瓜的枯萎病病情指數(shù)高達(dá)90.00%，顯著高于其他處理，表現(xiàn)為高感。

2.2 單瓜質(zhì)量及小區(qū)產(chǎn)量的差異

從表2可知，嫁接冬瓜的單瓜質(zhì)量達(dá)19.38 kg，小區(qū)產(chǎn)量達(dá)416.40 kg，均顯著高于自接冬瓜，加之嫁接冬瓜高抗冬瓜枯萎病，說明該砧木嫁接的冬瓜在生產(chǎn)中的表現(xiàn)較好。

2.3 根系分泌物對(duì)冬瓜枯萎病病菌的化感效果

從表3可知，在處理后3～6 d，自接冬瓜根系分泌物對(duì)冬瓜枯萎病的化感效果均表現(xiàn)為促進(jìn)作用，而自接南瓜和嫁接冬瓜根系分泌物化感效果均表現(xiàn)為抑制作用;自接南瓜和嫁接冬瓜根系分泌物對(duì)枯萎病病菌抑制效果的差異不顯著，而與自接冬瓜的化感效果差異達(dá)到顯著水平。嫁接冬瓜根系分泌物化感效果隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)而不斷增強(qiáng)，而自接冬瓜根系分泌物化感促進(jìn)效果隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)而降低。

2.4 根系分泌物的成分及含量分析

按照相似度大于90%的原則鑒定出3種植株根系分泌物中含有28種化合物，其相對(duì)含量見表4。從表4可知，根系分泌物的成分復(fù)雜，包括酯類、醇類、烷類、酮類、胺類等，其中酯類物質(zhì)含量最高。

另外，從表4還可以發(fā)現(xiàn)，嫁接冬瓜根系分泌物的種類比自接南瓜要多，自接南瓜中不含的物質(zhì)有2，3-丁二硫醇、（Z）-9-十八烯腈、甲基氨-聚乙二醇-丙酸叔丁酯、1，2-雙（三甲基硅氧基）乙烷、1，3-二-正-丙基-1，1，3，3-四甲基二硅氮烷、4-（三甲基硅基）嗎啉和2，3，4，6-四-O-（三甲基硅烷基）己糖吡喃糖苷。嫁接冬瓜和自接南瓜根系分泌物中均含有而自接冬瓜不含的物質(zhì)有1-（3-甲基丁基）-2，3，4，6-四甲苯、3-吡啶醇、雙（三甲基硫化硅）和N-乙基-1，1，1-三甲基-N-（三甲基硅烷基）硅烷胺，但其相對(duì)含量均小于1%。嫁接冬瓜和自接南瓜根系分泌物相對(duì)含量顯著高于自接冬瓜的物質(zhì)包括硬脂酸-2，3-二（三甲基硅氧）丙基酯、四甲基硅烷丙三醇、N-（叔丁基二甲基硅烷）-N-三氟乙酰胺、三甲基硅烷N，N-二甲基氨甲酸鹽、三甲基硅烷基棕櫚酸酯、丙胺，二甲基硅烷衍生物和1，1，1，3，3-五甲基-3-乙酰氧基二硅氧烷;均比自接冬瓜根系分泌物相對(duì)含量顯著低的物質(zhì)為三甲基甲硅烷醇三硅甲烷氧基乳酸酯，這些物質(zhì)的相對(duì)含量均大于1%。

3 討論與結(jié)論

本研究結(jié)果表明，自接冬瓜易感冬瓜枯萎病，嫁接冬瓜和自接南瓜高抗冬瓜枯萎病;單瓜質(zhì)量和產(chǎn)量也明顯高于自接冬瓜，表明選用海砧1號(hào)作為砧木用來嫁接冬瓜是可推廣應(yīng)用的。前人研究發(fā)現(xiàn)，抗病棉花的根系分泌物能夠抑制枯萎病菌厚垣孢子的形成[15];用抗病黃瓜根系分泌物處理接種枯萎病菌后的植株，發(fā)病率比用感病品種根系分泌物處理的低17%[16]。對(duì)3類植株的根系分泌物成分與含量分析發(fā)現(xiàn)，三者之間存在著明顯差異，故認(rèn)為根系分泌物的不同是植株抗病性強(qiáng)弱不同的原因[17]。

本研究結(jié)果表明，南瓜嫁接冬瓜的根系分泌物和自接南瓜的根系分泌物對(duì)冬瓜枯萎病菌均具有化感抑制作用，且沒有明顯差異，這與前人將感病接穗嫁接到抗病砧木會(huì)降低嫁接植株的抗性的研究結(jié)果不一致[9]，嫁接不只是簡(jiǎn)單的換根，砧穗互作會(huì)影響砧木根系的發(fā)育[18]和接穗的光合特性[19]等，繼而改變嫁接冬瓜根系分泌物的成分和含量。在本研究中發(fā)現(xiàn)，隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)，嫁接冬瓜根系分泌物的化感抑制效果明顯增強(qiáng)，這可能與疊加作用有關(guān)[20];自接冬瓜根系分泌物的化感促進(jìn)效果逐漸下降可能與根系分泌物中存在可被分解或有揮發(fā)性的有效成分[21]，或病原菌對(duì)化感物質(zhì)產(chǎn)生一定的抗性或耐性及菌絲細(xì)胞具有一定自身緩沖能力有關(guān)[22]。

南瓜嫁接提高冬瓜枯萎病抗性的機(jī)制是嫁接改變了根系分泌物組分，且含有相對(duì)較多的抑制冬瓜枯萎病病菌菌絲生長(zhǎng)的成分。但對(duì)根系分泌物成分特性的影響及其化感效應(yīng)如何，還有待于進(jìn)一步研究。

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