自噬相關蛋白LC3-Ⅱ和p62在不明原因復發性流產患者絨毛組織中的表達和臨床意義*

宋鵬書，張燕華，張奕梅，莫梅珍，何 升，張 莉

廣西壯族自治區婦幼保健院婦產科，廣西南寧 530003

復發性流產是指3次或3次以上發生在20周之內的妊娠失敗，發生率高達3%～5%[1]。復發性流產病因復雜多樣，可能與遺傳因素、感染因素、免疫學因素、內分泌因素等有關，且約50%的復發性流產為不明原因復發性流產(URSA)[2]。

自噬是一種高度保守的細胞行為，其通過泛素蛋白酶系統維持細胞內穩定，是由雙層膜性結構對細胞內成分進行包裹，之后通過與溶酶體結合從而將包裹的內容物進行分解、再利用的過程[3-4]。近年研究發現，自噬反應活性失調對妊娠期并發癥的發生存在不可忽視的影響[5]。但有關復發性流產與自噬的相互關系報道較為少見。本研究探討了自噬相關蛋白LC3-Ⅱ、p62在URSA患絨毛組織中的表達情況，分析URSA結局與絨毛組織發生自噬反應的相關性，旨在研究URSA的發生機制，為進一步尋找新的臨床干預方法提供理論依據。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2020年3-7月在本院婦產科行清宮術URSA患者及行人工流產術的正常妊娠者分別作為URSA組和對照組，每組10例。兩組患者診斷標準均參照第9版《婦產科學》。URSA組平均年齡(32±6)歲，平均孕周(10±2)周，納入標準：(1)超聲檢查子宮發育正常；(2)夫婦染色體核型檢查正常；(3)甲狀腺功能檢查正常；(4) 無血栓形成傾向；(5)自然流產次數≥3次；(6)排除免疫及感染因素影響。對照組平均年齡(30±4)歲，平均孕周(10±2)周，無不良孕產史，正常妊娠次數≥1次。本研究獲本院倫理委員會批準，所有研究對象自愿簽署知情同意書。

1.2主要試劑 多聚甲醛固定液購自Sigma公司；兔抗人LC3單抗隆抗體購自CST公司；兔抗人p62多克隆抗體購自SAB公司；兔抗人β-actin多克隆抗體購自北京博奧森公司；BCA蛋白定量試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司；山羊抗兔熒光二抗購自Abcam公司；顯影液購自Bio-Rad公司。

1.3方法

1.3.1絨毛組織留取 在人工流產術或清宮術術中妊娠組織清出后 3 min內，迅速于無菌狀態下挑選絨毛組織，用無菌生理鹽水沖洗干凈，將其分為三份：兩份分別置于已備制好的體積分數為4%的多聚甲醛液中固定 24 h，用于HE染色和免疫組化實驗；另一份置于凍存管中，將其迅速放入液氮內，然后移至-80 ℃冰箱保存，用于目的蛋白表達量檢測。

1.3.2絨毛組織病理學觀察 取固定24 h的絨毛組織，組織塊脫水，石蠟包埋，切成厚度4 μm薄片，放入37 ℃溫水使切片伸展，貼至載玻片上，依次浸入二甲苯、乙醇脫蠟，蒸餾水沖洗，然后將載玻片放入蘇木精溶液中染色，流水沖洗，放入37 ℃溫水中進行返藍，晾干，中性樹膠封固保存，電子顯微鏡觀察染色情況。

1.3.3Western blot檢測絨毛組織中自噬相關蛋白LC3-Ⅱ、p62的表達 取-80 ℃冰箱保存的絨毛組織，稱質量后剪碎放入EP管中，用電動勻漿機研磨碎，加入組織裂解液，放在冰盒上裂解40 min，4 ℃，12 000×g離心20 min，提取組織總蛋白，采用BCA法檢測蛋白濃度。采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離樣品蛋白，轉至PVDF膜，脫脂奶粉室溫封閉30 min，TBST沖洗3次，每次5 min。加入LC3和p62單克隆一抗(1∶500)4 ℃搖晃孵育過夜，TBST沖洗3次，每次5 min，加入二抗室溫孵育1 h，然后于顯影液中孵育5 min，上機檢測。采用Quantity One軟件分析目的蛋白相對表達水平。

1.3.4免疫組化實驗檢測絨毛組織中自噬相關蛋白LC3、p62的表達 取固定24 h的絨毛組織，組織塊脫水，石蠟包埋，切成厚度5 μm薄片，放入37 ℃溫水表面便于切片伸展容易貼到載玻片上，再依次浸入二甲苯、乙醇脫蠟，高壓修復，3%過氧化氫溶液中孵育。用PAP筆在組織切邊畫圈，然后滴加封閉液。一抗LC3和p62(1∶200)孵育過夜，二抗孵育20 min，二氨基聯苯胺(DAB)顯色液顯色5 min。蘇木精染色1 min，分化返藍，梯度乙醇脫水，樹膠封片，電子顯微鏡觀察陽性面積大小。

2 結 果

2.1兩組絨毛組織的病理學結果 HE染色結果顯示，對照組絨毛組織內部細胞形態飽滿，細胞核呈梭子型，絨毛組織外部完整，URSA組絨毛組織內部細胞出現皺縮，顏色暗紅，細胞之間出現斷離，絨毛組織有破損。見圖1。

圖1 兩組流產絨毛組織HE染色結果(×200)

2.2Western blot檢測自噬相關蛋白LC3-Ⅱ和p62在流產絨毛組織中的表達 Western blot檢測結果顯示，與對照組相比，URSA組的絨毛組織中LC3-Ⅱ 的蛋白表達量顯著增加；同時，p62蛋白的表達量顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖2。

注：A為Western blot檢測結果；B為蛋白定量分析;與對照組比較，aP<0.05。

2.3免疫組化實驗分析自噬相關蛋白LC3和p62在絨毛組織中的表達 免疫組化實驗結果顯示，LC3和p62蛋白主要定位于細胞質中。與對照組相比，URSA組LC3蛋白表達量上升， p62蛋白表達量降低，結果與Western blot 檢測結果一致。見圖3。

圖3 LC3和p62蛋白在兩組絨毛組織中的表達情況(×200)

3 討 論

流產常發生在妊娠早期，其發生率隨孕婦年齡的增長而升高。導致流產常見的因素包括免疫功能障礙、染色體異常、內分泌疾病及子宮畸形等。URSA是流產中的一種特殊類型，近年因其發病率呈上升趨勢而受到廣泛關注[6]。目前，URSA的發病機制尚不明確，且病因復雜，臨床治療尚處于探索階段，因此成為婦產科領域的研究重點與難點。

卵母細胞受精、胚胎植入前后的發育，以及妊娠期并發癥均涉及自噬的誘導，當滋養細胞早期處于缺氧和營養有限的環境下，自噬對其有重要的保護作用，利于其適應早期發育的微環境[7-8]。雖然自噬可以為細胞修復損傷的細胞器提供能量，但當其超過一定限度后，也可能破壞細胞結構，影響能量供應，引發自噬性細胞死亡[9-10]。近年研究顯示，與正常妊娠孕婦胎盤絨毛組織相比，流產、子癇前期、胎兒生長受限、妊娠期糖尿病等病理妊娠的孕婦胎盤組織中均出現自噬過程受損[11-12]。此外，KHIDER等[13]研究發現，無論是胎兒早產還是足月分娩，均與胎盤自噬活性降低有關。分娩實際上是一個炎癥持續過程，無論早產還是足月分娩，自噬活性的降低都會導致炎癥因子清除不足，從而導致促炎細胞因子釋放過多，最終引發不良分娩結局[14]。

細胞自噬是多種自噬相關基因和關鍵蛋白參與的動態過程，可通過這些分子的表達水平來評估自噬活性。在自噬循環過程中，LC3分子經酶切反應后形成胞質型LC3-Ⅰ，后與磷脂酰乙醇胺反應轉化為脂質型LC3-Ⅱ，該亞型附著在自噬體上直至與溶酶體融合形成自噬溶酶體[15-16]。LC3-Ⅱ是監測自噬水平穩定可靠的特異性標志物，其含量在一定程度上反映了自噬體的數量。p62也是自噬反應發生過程中的重要銜接分子，其水平變化與自噬強弱呈負相關，常與 LC3共同用于判斷自噬反應活性[17]。本研究中，Western blot和免疫組化實驗結果均顯示，與正常妊娠孕婦相比，URSA患者的絨毛組織中自噬相關蛋白LC3-Ⅱ上調，p62蛋白下調，差異有統計學意義(P<0.05)，提示在URSA患者絨毛組織中自噬水平增強。推測自噬與URSA發生的關系可能為:(1)滋養層細胞受到環境強烈刺激時，細胞中的自噬水平過度會直接導致自噬性細胞死亡;(2)過度自噬可通過自噬溶酶體途徑降解細胞中生存素等抗凋亡因子，導致細胞凋亡，從而引發URSA。自噬是一把“雙刃劍”。在妊娠早期滋養層細胞處于相對缺氧的環境中，缺氧環境可以誘導自噬的發生，細胞內的自噬體通過收集受損、老化的細胞器，產生新的能量以維持細胞正常增殖分化。如果滋養層細胞受的刺激過度，同樣會使細胞自噬反應激烈，使細胞中的細胞器大量受損從而使細胞死亡，最終導致復發性流產。謝冰等[18]研究發現，Beclin-1 mRNA及蛋白、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表達水平在稽留流產的絨毛及蛻膜組織中均上調，提示細胞自噬參與了稽留流產的發生，其主要原因是絨毛及蛻膜組織發生炎性反應。王婧瑤[19]研究發現，IGF2在胚胎停止發育絨毛組織中表達降低，mTOR通路調節自噬的作用缺失，導致自噬活動紊亂，進而使胚胎停止發育。本研究結果提示，自噬相關蛋白在URSA患者絨毛組織中高度表達也有可能是妊娠早期的絨毛組織發生炎性反應，絨毛組織細胞通過自噬過度激活以應對炎性反應，最終使得細胞發生自噬性死亡。

本研究為URSA發病機制的闡明提供了一定理論依據，可考慮將自噬相關蛋白LC3-Ⅱ、p62作為URSA早期診斷的標志物。但復發性流產的致病原因復雜，還需進一步深入研究。