VPA對VEGF誘導的HRMECs成管能力的影響及其機制*

于明洲，吳函書，冷 瀛

1.中國人民解放軍聯勤保障部隊第九六五醫院眼科，吉林吉林 132011;2.北華大學附屬醫院眼科，吉林吉林 132011

增殖型糖尿病性視網膜病變(PDR)中，異常新生的血管和結締組織可能導致視網膜脫離并危及視力。有研究發現，PDR中眼組織的新血管形成與血管內皮生長因子(VEGF)水平密切相關[1]。目前，PDR的標準治療方法都集中在PDR的晚期，并存在潛在不良反應[2-3]。丙戊酸(VPA)是一種能夠抑制細胞增殖的組蛋白去乙酰化酶抑制劑[4]。有研究報道，VPA能夠抑制內皮細胞的增殖及血管新生[5-6]。本研究通過觀察VPA對VEGF條件下人視網膜微血管內皮細胞(HRMECs)的影響，以期為PDR的治療找到新的思路。

1 材料與方法

1.1材料 HRMECs購自北京裕恒豐科技有限公司，RPMI 1640細胞培養液及胎牛血清購自Hylcone公司(美國)，磷酸鹽緩沖液(PBS，0.1 mol/L，pH 7.4)購自武漢博士德生物公司，VPA購自Sigma公司(美國)，VEGF購自PeproTech公司(美國)，CCK8試劑盒購自南京碧云天生物技術研究所，基質膠購自BD公司(美國)，遷移小室(Transwell)及胰酶購自Millipore公司(美國)，BCA蛋白定量試劑盒購自北京百泰克生物公司，兔抗人磷酸化-血管內皮細胞生長因子受體2(p-VEGFR2)、磷酸化-絲氨酸/蘇氨酸激酶(p-AKT)、磷酸化-細胞外調節蛋白激酶1/2(p-ERK1/2)購自CST公司(美國，貨號2478T、4060T、4370T)。

1.2方法

1.2.1細胞培養 用含有10%胎牛血清的RPMI 1640細胞培養液培養HRMECs，置于5%CO2、37 ℃恒溫細胞培養箱中培養。

1.2.2細胞增殖能力檢測 將對數生長期的HRMECs用0.25%的胰酶消化下來制成細胞懸液，并接種到96孔培養板中，每孔細胞懸液200 μL，細胞濃度1×104個/孔。設置細胞對照組、試劑對照組、VPA處理組(VPA終濃度分別為10、20、40、80、160 μmol/L)，每孔均含VEGF 10 ng/mL。在5% CO2、37 ℃孵箱中分別孵育24 h和48 h，處理與培養結束后，各孔分別加入10 μL CCK8試劑，輕輕搖晃混勻，4 h內用酶標儀檢測450 nm波長下各孔的吸光度(A)值，計算各組細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率=[1-(AVPA處理組-A試劑對照組)/(A細胞對照組-A試劑對照組)]×100%。

1.2.3細胞遷移能力檢測 將處理后的各組HRMECs用胰酶消化，用RPMI 1640細胞培養液制成單細胞懸液，Transwell上室內接種濃度為5×104個/孔的HRMECs。Transwell下室內加入10%胎牛血清的內皮細胞培養基及終濃度為50 ng/mL的VEGF共600 μL。經20 h共培養后取出Transwell小室，棄去上室培養液，上室內未遷移的細胞用棉簽擦去，PBS洗3遍。95%的乙醇固定膜下表面細胞，取下Transwell小室膜，經結晶紫染色后置于載玻片上用中性樹膠封片。在100倍光學顯微鏡下觀察遷移細胞的數量，隨機選取5個視野計數，計算平均遷移細胞數。

1.2.4細胞體外成管能力檢測 在冰上將預先4 ℃過夜融化的基質膠與無血清培養基(含100 ng/mL的VEGF)按1∶1混合加入預冷的24孔板，每孔300 μL， 然后置于37 ℃孵育1 h使其成膠。將處理好的各組HRMECs用含10%胎牛血清的培養基制成單細胞懸液，HRMECs以5×104個/孔的密度接種于預置基質膠的24孔板內，37 ℃孵育24 h，在100倍光學顯微鏡下觀察，隨機選取3處管腔密集處計數。

1.2.5蛋白表達檢測 收集處理好的各組HRMECs，每組加入裂解液(RIPA裂解液與PMSF以100∶1的比例配制)100 μL，用移液槍反復吹打使細胞與裂解液充分接觸，冰上靜置30 min，低溫離心機中4 ℃、10 000 r/min離心15 min后，將上清液移至新的EP管中。用BCA法定量各組上清液中蛋白質濃度。在恒壓條件下采用SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白質，然后以250 mA恒定電流將蛋白質轉印至PVDF膜上。PVDF膜放入5%的脫脂牛奶中37 ℃下封閉3 h后，加入一抗4 ℃孵育過夜，洗滌3次，加入二抗37 ℃孵育2 h，ECL化學發光法顯影，采集圖像，用Quantity One圖像分析軟件測定灰度值。

2 結 果

2.1VPA對VEGF誘導的HRMECs增殖能力的影響 CCK8實驗結果顯示，A值隨著VPA濃度的增高而減小，提示隨著VPA濃度增高活細胞數減少，并且隨著VPA作用時間的增加，其對HRMECs的增殖抑制增強，見圖1。結果表明，VPA能夠抑制HRMECs的增殖，且VPA在0～160 μmol/L的濃度范圍內與HRMECs的增殖能力呈負相關。VPA處理 24 h和48 h的半效抑制濃度(IC50值)分別為160.37 μmol/L和78.95 μmol/L。因此，在后續實驗中以作用時間48 h、濃度40 μmol/L作為VPA處理方式(VAP處理組)，以不加藥物的HRMECs作為對照組。

圖1 VPA對VEGF誘導的HRMECs增殖能力的影響

2.2VPA對VEGF誘導的HRMECs遷移能力的影響 Transwell小室遷移實驗結果顯示，HRMECs經40 μmol/L VPA處理48 h后，穿過Transwell小室膜的細胞數目明顯減少，差異有統計學意義(P<0.05)，結果表明HRMECs的遷移能力明顯降低，見圖2，提示VPA能抑制VEGF誘導的HRMECs細胞遷移。

2.3VPA對VEGF誘導的HRMECs體外成管能力的影響 基質膠體外成管能力實驗結果表明，HRMECs經40 μmol/L VPA處理48 h后，HRMECs在基質膠上形成的管腔樣結構的數量明顯減少，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖3。結果提示，VPA能夠抑制VEGF誘導的HRMECs體外形成管腔的能力。

注：A為對照組；B為VPA處理組；C為兩組定量分析結果；與對照組比較，*P<0.05。

2.4VPA對HRMECs蛋白表達的影響 Western blot結果表明，VEGF組較對照組p-VEGFR2、p-AKT以及p-ERK1/2的蛋白水平均有升高，而HRMECs經40 μmol/L VPA處理48 h后，細胞中VEGF介導的信號通路相關蛋白的水平發生變化。其中，p-VEGFR2及其下游的p-AKT及p-ERK1/2的蛋白水平均降低，差異均有統計學意義(P<0.05)，見圖4。結果表明，VPA能引起存在于內皮細胞表面的VEGFR2磷酸化水平降低，以及降低內皮細胞增殖及遷移相關蛋白AKT、ERK1/2的磷酸化水平。

注：A為 Western blot檢測蛋白表達結果；B為蛋白定量分析結果；與對照組比較，*P<0.05。

3 討 論

糖尿病性視網膜病變是糖尿病性微血管病變中最重要的表現，PDR中新生血管生長影響并通過多種因素導致嚴重視力下降，甚至完全失明。血管新生是一個由內皮細胞構成新血管的復雜過程。血管內皮基質降解、內皮細胞遷移、內皮細胞增殖、內皮細胞管道化分支形成血管環等步驟是血管生成的主要過程[7]。本研究結果發現，組蛋白去乙酰化酶抑制劑VPA明顯抑制了VEGF誘導的HRMECs增殖，并且這種抑制能力于一定的時間和劑量范圍內呈正相關。此外，VPA也能夠抑制VEGF誘導的HRMECs細胞體外成管及細胞遷移。以上結果表明，VPA具有抑制VEGF引起的HRMECs血管新生作用。

VEGF水平在很大程度上影響糖尿病性視網膜病變患者眼組織新血管形成。高葡萄糖水平對血管內皮細胞的損害作用引起一些血管閉塞導致缺氧和局部缺血[8]。而通過缺氧產生的低氧誘導因子-1誘導的VEGF是眼新血管形成的關鍵調節劑，并且在視網膜內皮細胞和周細胞上存在高親和力的VEGF受體[9-10]。VEGF是一類由細胞產生的能夠引起血管生成的信號蛋白，它與生理狀態下及病理狀態下的血管新生有著密切聯系[11]。過度表達的VEGF可能引起視網膜和身體其他部位的血管疾病。VEGF與周圍血管壁靜止內皮細胞表面的VEGFR2結合，觸發內皮激活和下游血管生成的信號通路[12]。當VEGF與內皮細胞膜上的VEGFR2結合，引起受體自身磷酸化，從而進一步引發內皮細胞中AKT和ERK的磷酸化，誘導內皮細胞增生，進而引起一系列的血管生成進程[13]。此外，VEGFR2介導的AKT和ERK的磷酸化對內皮細胞的遷移能力具有關鍵的調節作用[14-15]。因此，VEGF對新生血管形成的促進作用可能是通過磷酸化VEGFR2進而引起下游AKT、ERK的磷酸化水平增高來實現的。本研究結果發現，VPA能夠抑制HRMECs的增殖、遷移及體外成管能力，VPA能夠降低VEGF誘導的p-VEGFR2、p-AKT和p-ERK1/2的蛋白水平。因此，可以推測VPA對HRMECs增殖、遷移及成管能力的抑制可能是通過下調VEGF誘導的p-VEGFR2、p-AKT和p-ERK1/2的蛋白水平來實現的。

組蛋白去乙酰化酶抑制劑VPA能夠在體外抑制VEGF誘導的HRMECs的增殖、遷移及成管能力，其可能的機制為VPA抑制了VEGF介導的VEGFR2磷酸化水平及其下游AKT/ERK信號通路。