癲癇患兒血清α-突觸核蛋白和熱休克蛋白70的表達及臨床意義*

黃凌鋒，廉榮鎮，肖 能，歐陽純，陳 薇

郴州市第一人民醫院兒科，湖南郴州 423000

癲癇是臨床常見的一種中樞神經系統疾病，在兒童中患病率較高，我國癲癇每年患病率約為7%，其中10歲以下兒童占比達3.45%[1]。癲癇具有反復發作的特點，并伴有呼吸系統紊亂、循環系統紊亂、肌肉抽搐等表現，對神經元造成的損害較大，可影響腦代謝功能，隨著神經元結構改變，甚至會導致認知障礙[2]。近年來，有學者發現，α-突觸核蛋白(α-Syn)可導致線粒體結構受損，從而破壞神經細胞功能，可能引起認知障礙[3]。因此，臨床有理由推測，α-Syn可能與癲癇患兒認知障礙發生有關。另有研究發現，熱休克蛋白(HSP)可能與癲癇進展有關，例如，癲癇患者神經細胞受損后，其變性蛋白質對熱休克蛋白70(HSP70)生成有誘導作用[4]。目前，臨床對癲癇患兒α-Syn、HSP70的研究仍處于初步探索階段，其具體作用機制尚未明確。基于此，本研究觀察癲癇患兒血清α-Syn、HSP70與認知功能、事件相關電位及血清炎癥細胞因子的關系，以期為臨床診療提供思路，現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取本院2016年8月至2019年8月收治的癲癇患兒105例作為癲癇組。癲癇診斷參考《小兒癲癇的診斷與治療》[5]：(1)臨床發作。(2)腦電圖檢查提示癇樣放電。①每天癲癇發作>3次，提示癲癇頻發；②發作持續時間≥30 min或短期連續間斷發病≥30 min，但間歇期未達到發病前狀態，提示癲癇持續狀態；③無上述特征的癲癇患兒即為非頻發非持續狀態。癲癇組男63例，女42例；年齡4～12歲，平均(8.72±3.25)歲；身高130～147 cm，平均(138.04±3.96)cm；體質量24～33 kg，平均(28.92±3.26)kg。根據患兒癲癇類型，將癲癇組患兒分為癲癇1組(癲癇頻發)24例，癲癇2組(癲癇持續狀態)38例，癲癇3組(非頻發非持續狀態)43例。另選取在本院進行體檢的健康兒童68例作為健康對照組，其中男37例，女31例；年齡5～13歲，平均(9.09±3.65)歲；身高131～145 cm，平均(137.53±4.48)cm；體質量23～35 kg，平均(29.08±4.72)kg。兩組性別、年齡、身高、體質量比較，差異無統計學意義(P>0.05)。本研究方案獲醫院倫理委員會批準，受試者家屬均簽署知情同意書。

1.2納入、排除標準 (1)納入標準。癲癇組：①年齡≤15歲，符合上述關于癲癇的診斷標準；②經體檢，未見神經系統陽性體征；③原發性癲癇，未見癲癇相關并發癥；④病例資料完整；⑤監護人對研究內容知情同意。健康對照組：①身體健康狀況良好；②性別、年齡等基線資料與癲癇組匹配；③監護人對研究內容知情同意。(2)排除標準：①入院前服用過抗癲癇藥物者；②因顱腦外傷等其他非癲癇因素引起的認知障礙者；③因腦出血、中樞神經系統感染等誘發的繼發性癲癇者；④近期使用過免疫抑制劑、激素類藥物者；⑤重度營養不良者；⑥肝、腎、心等臟器嚴重受損者。

1.3儀器與試劑 主要試劑：人C反應蛋白(CRP)檢測試劑(北京世紀沃德生物科技有限公司)、人α-Syn檢測試劑(上海將來實業股份有限公司)、人HSP70檢測試劑(美國eBioscience)以及血清白細胞介素-1β(IL-1β，成都超九八生物)、白細胞介素-6(IL-6，上海紀寧生物)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α，美國eBioscience公司)檢測試劑。主要儀器：全自動生化分析儀(深圳邁瑞醫療，MR-96A)、誘發電位儀(上海企晟醫療器械有限公司，Nicolet EDX型)。

1.4方法

1.4.1檢測方法 健康對照組在體檢當日接受各項檢查，癲癇組在治療前進行檢查。(1)血清指標檢測：在受試者空腹狀態下，采集4 mL靜脈血，3 000 r/min離心20 min，離心半徑為15 cm，分離血清，存放于-70 ℃低溫冰箱待測。采用免疫比濁法檢測血清CRP水平。采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)測定血清α-Syn、HSP70、IL-1β、IL-6、TNF-α水平，嚴格根據試劑盒說明書操作。(2)事件相關電位P300檢查：經誘發電位儀檢測，設置非靶刺激、靶刺激2個等級，頻率分別為750、2 000 Hz，將二者組成刺激序列。受試者選擇坐位，通過耳機給聲的形式誘發，根據國際電生理學會制定的標準[6]進行檢測，記錄P300波幅、P300潛伏期。(3)認知功能評估：參考中國韋氏兒童智力量表(C-WISC)[7]評價，該量表含有言語測驗、操作測驗2個部分，前者包括領悟、算術、知識、詞匯、數字廣度、相似，后者包括數字符號、積木、拼圖、填圖、排列。相對有效范圍為55～145分，分值越高，提示智力越好。

1.4.2治療方法 癲癇組在接受上述檢查后，給予抗癲癇治療，其中有54例經丙戊酸鈉(上海青平藥業有限公司，國藥準字H31020728)治療，劑量10～20 mg/(kg·d)，療程3～5 d。51例采用卡馬西平(北京諾華制藥有限公司，國藥準字H11022279 )治療，劑量10～40 mg/(kg·d)，療程7～14 d。

2 結 果

2.1兩組血清α-Syn、HSP70及炎癥因子水平比較 癲癇組血清α-Syn、HSP70、IL-1β、IL-6、CRP、TNF-α水平均高于健康對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 兩組血清α-Syn、HSP70及炎癥因子水平比較

2.2兩組C-WISC評分、事件相關電位P300比較 癲癇組C-WISC評分低于健康對照組，而P300潛伏期較健康對照組明顯延長，差異均有統計學意義(P<0.05)，兩組P300波幅比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 兩組C-WISC評分、事件相關電位比較

2.3癲癇1、2、3組患兒α-Syn、HSP70及認知評分、事件相關電位、炎癥因子比較 癲癇1組、癲癇2組的血清α-Syn、HSP70、IL-1β、IL-6、CRP、TNF-α水平均高于癲癇3組，且P300潛伏期長于癲癇3組，而癲癇1組、癲癇2組的C-WISC評分低于癲癇3組，差異均有統計學意義(P<0.05)，其中癲癇2組血清IL-6、CRP、TNF-α水平低于癲癇1組，差異有統計學意義(P<0.05)，癲癇1、2、3組患兒P300波幅比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 癲癇1、2、3組患兒α-Syn、HSP70及認知評分、事件相關電位、炎癥因子比較

2.4癲癇患兒血清α-Syn、HSP70與認知功能評分、事件相關電位、炎癥因子的相關性 Pearson線性相關分析顯示，血清α-Syn、HSP70與C-WISC評分呈負相關(P<0.05)，與P300潛伏期及血清IL-1β、IL-6、CRP、TNF-α呈正相關(P<0.05)，二者與P300波幅無相關性(P>0.05)。見表4。

表4 癲癇患兒血清α-Syn、HSP70與認知功能評分、事件相關電位、炎癥因子的相關性

續表4 癲癇患兒血清α-Syn、HSP70與認知功能評分、事件相關電位、炎癥因子的相關性

3 討 論

癲癇是兒童中的常見病，對神經系統功能影響較大，在這類患兒中，30%～40%的病例出現智力損害，癲癇后認知功能障礙發生機制比較復雜，是多因素作用的結果，包括發作頻次、病灶部位、癲癇類型、抗癲癇藥應用情況等[8]。近年研究發現，α-Syn可通過對線粒體外膜進行干擾，導致其結構受損，誘發氧化應激，對神經細胞功能有損害作用[9]。這提示α-Syn可能對癲癇后神經功能損害有影響。HSP70是熱休克蛋白的重要組成部分，其在健康腦組織中含量較少，而在癲癇發作時可見HSP70聚集[10]。故臨床可考慮將血清α-Syn、HSP70用于癲癇患兒的病情評估，但現階段臨床對二者在癲癇中的作用機制尚未完全明確，仍需大量研究予以論證。

本研究結果顯示，與健康兒童相比，癲癇患兒的血清α-Syn、HSP70增高(P<0.05)。α-Syn在神經組織內存在表達，對腦神經元有調節作用，其表達改變可能與其異常聚集存在關聯，而氧化應激能促進α-Syn聚集[11]。α-Syn在表達水平較低時，能保護神經元，可發揮一定的抗過氧化氫功能，但其表達水平較高時，則會對神經元產生毒性，致神經功能受損[12]。HSP70能與聚集、錯折疊、新生的蛋白質結合，解離某類蛋白質，使不溶性聚集物減少，在病理情況下釋放入血。在癲癇發病后，腦細胞能對應激反應進行誘導，這種應激反應主要由蛋白質合成、蛋白質變性等機制所致，而變性蛋白質能誘導HSP70生成[13]。因此，癲癇后血清HSP70水平增高。本研究發現，癲癇患兒的血清IL-1β、IL-6、CRP、TNF-α水平均較健康兒童增高，提示癲癇患兒機體存在炎癥。研究證實，炎癥參與了癲癇病情進展，其能將機體抗癲癇途徑阻斷，導致癲癇加重，促使患兒處于持續癲癇狀態，加重神經元損害[14]。這與本研究結論基本一致，因此，在癲癇的治療中，臨床需注重抗炎處理，緩解病情。

本研究結果提示，與健康兒童相比，癲癇患兒的C-WISC評分下降，而P300潛伏期延長，差異均有統計學意義(P<0.05)。P300電位能反映癲癇患兒的認知損害程度，潛伏期越長，表明大腦感知信息的能力越弱，出現明顯的學習障礙以及信息加工能力損害[15]。本研究顯示，癲癇患兒P300潛伏期延長，進一步證實其存在認知障礙。本研究結果還發現，與非頻發非持續狀態患兒相比，癲癇頻發、癲癇持續狀態患兒的血清α-Syn、HSP70水平更高(P<0.05)。α-Syn能與多巴胺結合生成多巴胺醌-突觸核蛋白，導致神經元毒性增強[16]。而癲癇頻發、癲癇持續狀態者因癲癇發作頻繁，間歇時間短，對神經元造成的損害更大，可能促進血清α-Syn表達進一步上調。HSP70對受損細胞有保護作用，但在應激狀態下，其表達反而增高，原因可能在于，在出現應激損傷后，機體啟動保護機制，產生應激性HSP70表達增高[17]。此外，本研究結果顯示，3組患兒，癲癇3組的炎癥因子水平最低，C-WISC評分最高，P300潛伏期最短，原因可能在于該組患兒癲癇程度最輕，其所遭受的神經元毒性最弱，故機體狀態相對較好。

本研究結果顯示，血清α-Syn、HSP70水平與C-WISC評分呈負相關(P<0.05)，而與P300潛伏期及血清IL-1β、IL-6、CRP、TNF-α水平呈正相關(P<0.05)。α-Syn呈高表達時，可上調Bax表達，導致半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶活性增強，對線粒體細胞色素C的大量釋放有促進作用，可使細胞凋亡，加重炎性反應，損害認知功能，而其低表達可發揮抗過氧化氫作用，對神經元有一定保護作用[18]。HSP70在海馬、丘腦等部位表達水平較高，上述區域均與認知功能密切相關，在出現影響腦功能的疾病時，可導致與認知功能相關區域受損，促進炎癥介質釋放，損害認知功能，在這種情況下，可能致HSP70表達應激性增高[19]。臨床可將調節癲癇患兒的血清α-Syn、HSP70水平作為治療新思路，改善預后。蘇玉強等[20]研究發現，認知障礙大鼠的HSP70水平上升時，其神經元損害減輕。而本研究結果提示，在癲癇患兒認知功能受損情況下，HSP70反而出現應激性增高，分析原因可能與HSP70在發病后不同階段的表達差異有關，或者與導致認知障礙的原發因素有關，這有待進一步探討。

綜上所述，癲癇患兒的血清α-Syn、HSP70水平較健康兒童明顯增高，且二者變化受認知功能、P300潛伏期及機體炎癥的影響。本研究局限性在于樣本量較小，未來還需擴大樣本量進行更深入的研究。