犬源大腸桿菌分離鑒定及耐藥性分析研究

劉杉杉，孫偉，郭盈盈，李加英，田維倩，冉鋼

（1.銅仁職業技術學院 貴州銅仁 554300；2.民族中獸藥分離純化技術國家地方聯合工程研究中心 貴州銅仁 554300）

健康動物機體腸道內存在的大腸桿菌，多數并不致病。作為動物腸道內的共棲菌，大腸桿菌還能夠產生抑制致病性大腸桿菌生長的大腸桿菌素。近年來，隨著各種抗生素的濫用，大腸桿菌的耐藥性呈顯著增加的趨勢[1]，以往的很多特效藥效果變差甚至無效。寵物感染大腸桿菌不僅能影響到治療效果，而且攜帶耐藥基因的大腸桿菌可能會感染人，影響人類健康和疾病治療效果[2-4]。我國多省份都有關于寵物犬大腸桿菌耐藥性嚴重情況的報道[5-7]。

銅仁市某養殖場從建立至現在已有數年，從未進行大腸桿菌耐藥性試驗分析。為了解該養殖場大腸桿菌耐藥的具體情況，本研究將從該養殖場采集2 只健康犬肛門拭子，分離大腸桿菌，進行耐藥性分析。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與培養基

頭孢噻吩、四環素、環丙沙星、慶大霉素、萘啶酸和氧氟沙星藥敏紙片由Oxoid 公司生產。

普通LB 瓊脂和液體培養基、胰酪胨大豆肉湯培養基、麥康凱瓊脂培養基均由青島海博生物公司提供。

1.2 樣品采集

采集養殖場2 只健康犬肛門拭子樣品，置于裝有0.85%無菌生理鹽水的樣品采集管中，常溫保存備用。采集過程中要注意對樣品做好標記，謹防樣品污染。

1.3 大腸桿菌分離鑒定

將含有肛門拭子的樣品采集管渦旋振蕩混勻，靜置后用接種環取上清液1～2 環進行涂片，室溫下自然干燥，經火焰固定后，進行革蘭氏染色，并在顯微鏡下觀察細菌形態。

同時對采集的樣品進行細菌培養，將其分別劃線接種于麥康凱瓊脂培養基和營養瓊脂培養基，37℃培養24 h 后，觀察菌落形態，挑取疑似菌落再次進行革蘭氏染色鑒定。菌落繼續做純化增菌后，利用大腸桿菌16S rDNA 特異性引物（F:5'-GCGGACGGGTGAGTAATGT-3'和R:5'-TCATCCTCTCAGA CCAGCTA-3'，引物由上海生工生物工程有限責任公司合成）進行PCR 鑒定[8]。

1.4 藥敏試驗

采用K-B 藥敏紙片法，對分離的犬大腸桿菌進行藥物敏感性檢測。最終判斷結果，參考美國臨床和實驗室標準化協會（CLSI）標準[9]。

2 結果

2.1 大腸桿菌的分離鑒定

將兩只犬肛門拭子樣品進行革蘭氏染色檢查，結果均顯示為革蘭氏陰性菌，且為桿狀，中等大小。接種營養瓊脂培養基，長出半透明無色菌落，中等大小，邊緣整齊。接種麥康凱瓊脂培養基，長出紅色菌落，且表面光滑，邊緣整齊。

利用大腸桿菌16S rDNA 特異性引物檢測擴增到陽性菌，經測序結果分析，成功分離到2 株犬源性大腸桿菌。

2.2 藥敏試驗

對分離的2 株犬源大腸桿菌分別進行藥敏試驗，并測定抑菌圈直徑，結果見表1。結果表明不同犬只分離出來的大腸桿菌具有不同的耐藥性，其中一只犬分離的大腸桿菌對頭孢噻吩、四環素、環丙沙星和慶大霉素均耐藥，而對萘啶酸和氧氟沙星敏感；而另一只犬分離的大腸桿菌則對四環素、環丙沙星和和氧氟沙星均耐藥，對頭孢噻吩中度敏感，對萘啶酸和慶大霉素敏感。

表1 分離的兩株大腸桿菌抑菌圈直徑（mm）

3 討論與分析

多重耐藥表型一般定義為同時對3 類及3 類以上的抗生素耐藥[10]。本研究共選取了4 類抗菌藥物，即喹諾酮類、β -內酰胺類、氨基糖苷類和四環素類。統計結果表明，其中一株大腸桿菌對喹諾酮類和四環素類抗菌藥物具有耐藥性，而另一株大腸桿菌則對以上4 類抗菌藥物均出現不同程度的耐藥，即該養殖場已出現大腸桿菌的多重耐藥現象。

臨床上治療犬疫病時各類抗生素被廣泛使用甚至濫用，導致大腸桿菌耐藥菌株不斷產生。研究表明，耐藥菌株在犬體內極有可能會進一步傳播給人，或者通過環境作為媒介，再傳播給人，危害人類健康[11]。近年來，我國多地區均有較為嚴重的犬源大腸桿菌耐藥情況。該養殖場并沒有使用任何抗生素對犬只進行過疫病防治，但分離到的兩株大腸桿菌依然顯示了較強的耐藥性，且有多重耐藥。這些結果提示應該規范使用抗生素，以免造成更加嚴重的公共衛生問題。

臨床上治療小動物疾病，往往會選擇β -內酰胺類、氨基糖苷類和喹諾酮類為主要抗菌藥物。但本研究顯示，其中一只犬分離的大腸桿菌對慶大霉素敏感，頭孢噻吩亦抗菌效果欠佳，提示應引起獸醫臨床工作者的關注。

本研究僅是對兩只犬進行檢測就發現了抗生素的耐藥性，那么該養殖場是否存在更加廣泛的犬源性細菌耐藥性？有必要進一步開展犬源細菌耐藥性監測，并制訂抗菌藥物的使用規范。