莫能菌素高產菌株的選育

李子勇，李云飛，曾曉寧，梁景樂,2

（1.山東勝利生物工程有限公司 山東濟寧 272000；2.中牧實業股份有限公司 北京 100070）

莫能菌素（Monensin）亦稱莫能霉素、肉桂霉素和瘤胃素莫能菌素，屬五環多醚結構的酸性抗生素，它是由美國禮來公司（Eli Lilly）首先研制成功，在1967 年首先由Haney 等人從肉桂地鏈霉菌（Streptomyces cinnamonensis）的發酵液中分離得到，為聚醚類離子載體抗生素中應用最為廣泛的藥物之一[1]。

莫能菌素具有廣譜的抗球蟲活性，用于雞球蟲病防治和肉牛促生長。對革蘭氏陰性菌無作用；但對葡萄球菌、桿菌、梭菌、鏈球菌、霉菌（青霉菌、念珠菌）有一定的抑制作用。莫能菌素主要作為飼料添加劑直接飼喂動物，根據近年學者研究報道，對反芻動物作用主要是抑制瘤胃內革蘭氏陽性菌生長，提高瘤胃發酵產生的丙酸比例，抑制甲烷的產生，提高飼料能量的利用率，減少機體對蛋白質的浪費，從而促進動物生長，改善飼料轉化率。莫能菌素還能抑制乳酸產生菌的活性，減少乳酸的數量，預防動物乳酸中毒[2]。肉桂地鏈霉菌作為莫能菌素的生產菌種，其生產能力直接影響著發酵水平，而且生產企業使用的菌種一般為人工選育的非自然高產菌株，其次遺傳性能具有不穩定性，必須經常對其進行菌種選育，以保障生產性能。目前工業化生產的抗生素菌株主要通過誘變育種獲得，李依韋等[3]利用紫外誘變與化學誘變得到產量提高16.65%的高產菌株。秦艷飛等[4]通過紫外-氯化鋰誘變并結合氨基酸抗性篩選得到高產菌株產量提高72.5%。隨著生物技術的發展成熟，基因工程技術也被應用于菌種選育，但由于其對技術和設備要求比較高，過程復雜，費用較大，且成功率較低，誘變育種仍是工業菌種選育最為有效的手段[5]。

本文在紫外-氯化鋰雙重誘變基礎上[6]，結合瓊脂塊法篩選、搖瓶篩選誘變菌株，得到優質高產的肉桂地鏈霉菌菌株，經過冷凍保藏和傳代驗證后，生產能力保持穩定傳遞，運用到發酵車間大生產后，可大大提高發酵生產效率。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌種原始菌種：MON17042，山東勝利生物工程有限公司生產用菌種。生物測定指示菌：枯草芽孢桿菌，山東勝利生物工程有限公司保藏菌種。

1.1.2 培養基平板和斜面培養基：淀粉2%、瓊脂粉2.5%、硝酸鉀0.1%、硫酸鎂0.05%、硫酸亞鐵0.1%、氯化鈉0.05%、磷酸氫二鉀0.05%。

種子瓶培養基：口服葡萄糖0.5%、糊精2%、黃豆餅粉1.5%、酵母粉0.25%。

發酵瓶培養基：黃豆餅粉3.5%、口服葡萄糖3.5%、豆油2.0%、硫酸銨0.2%、氯化鋅0.03%、硫酸鎂0.007%、硫酸亞鐵0.005%、VC 0.0002%、磷酸氫二鉀0.005%、碳酸鈣0.25%。

1.1.3 試劑葡萄糖、酵母粉、淀粉、瓊脂粉、碳酸鈣、氯化鈉、氯化鋅、硫酸鎂、磷酸氫二鉀、硫酸銨、硫酸亞鐵等均為國產分析純。

1.1.4 儀器設備高效液相色譜儀，沃特世中國有限公司；SPH-322TD 型敞開式搖瓶機，上海世平實驗設備有限公司；SCB-1520 型超凈工作臺，北京東聯哈爾儀器制造有限公司；SPX-250B-2 型生化培養箱，上海博訊儀器有限公司；紫外線誘變箱，濟南杰康凈化設備廠；磁力攪拌器，南通麥格磁力機械有限公司。

1.2 方法

1.2.1 單孢子懸液制備將原始菌液梯度稀釋后涂布于分離培養基表面，33℃培養9～12d，挑取長勢良好的菌落傳斜面，作為出發菌株。向培養好的新鮮孢子斜面中加入10mL 的無菌水，用接種環將孢子刮下，振蕩打碎20～30min，四層濾紙過濾，得單孢子懸液[7]。

1.2.2 菌種的紫外線-氯化鋰復合誘變吸取MON17042 菌株的孢子懸液5mL 置于帶磁力攪拌器的平皿中放在紫外燈下進行照射，準確計時，UV 誘變的條件是：紫外燈功率20W，照射距離20cm，照射時間50s，誘變后把孢子懸液均勻涂布在加有1.0%氯化鋰的分離平板上，每個平板約滴入0.2mL 孢子懸液，共接分離平板20 支，33℃培養9～12d[8]。

1.2.3 瓊脂塊初篩待平皿剛剛長出針尖樣菌落時，用打孔器連同下面的瓊脂一起取出，轉移至無菌空平皿，保持相同的濕度，33℃培養3d。把每一長滿單菌落的瓊脂塊移至已混有指示菌的大塊瓊脂平板，33℃培養4d，分別測定各瓊脂塊的抑菌圈，并用原始菌株做對照。

1.2.4 搖瓶復篩挑選抑菌圈較大的單菌落傳斜面培養，培養成熟后編號保存，并轉接搖瓶進行復篩。搖瓶培養采用二級培養，挖取新鮮斜面（1cm× 1cm）接至裝有25mL 種子培養基的250mL搖瓶中，轉速200rpm，33℃培養20～26h 后，轉至裝有50mL 發酵培養基的500mL 發酵瓶中培養，接種量6%，8 層紗布用線繩扎緊，220rpm，33℃培養10d。

1.2.5 效價測定高效液相色譜—柱后衍生化—紫外檢測法[9]分離測定發酵液效價：用甲醇—水提取發酵液中的莫能菌素，以甲醇—冰乙酸—水（體積比94:3:3）作為流動相，香草醛為衍生劑，流動相和衍生劑流速均控制0.7mL/min，反應溫度95℃，采用C18的色譜柱，檢測波長520nm，進樣量20μL。

1.2.6 穩定性考察得到的高產突變株進行傳代和4℃冰箱保存試驗，以觀察其傳代穩定性和4℃冰箱保藏過程中生產能力的穩定性。本研究考察了突變株1～5 代在4℃冰箱斜面分別保藏30、60、90、120d 的搖瓶發酵產量水平，以觀察其穩定性。

2 結果與分析

2.1 篩選結果

經誘變處理后，從分離平板中挑出26 個抑菌圈較大的菌株進行搖瓶培養，測定效價，得到3 株產量明顯超過原始菌，且每株增長幅度均在35%以上。結果見表1。

表1 突變菌株與出發菌株對照

2.2 遺傳穩定性考察結果

將3 支高產菌株在斜面培養基上連續進行0～4℃保存、傳代，同等條件下搖瓶發酵后再測定其放瓶效價，結果見表2。

表2 突變菌株傳代、冷藏后的搖瓶發酵表現（μg/mL）

從表2 可知高產突變菌株連續傳代5 次，其發酵能力幾乎沒有下降，保持比較穩定。從第6 代開始有一定幅度的下降，但并不影響其總體發酵能力。菌種保藏時間比較試驗顯示，在0～4℃的溫度條件下保藏菌種，4 個月后菌種代謝能力稍有下降，但總體變化不大。現階段該莫能菌素發酵生產一般使用F2 斜面作為生產菌種接瓶進罐，每批進罐菌株的制作間隔原則上也不會超過三個月，所以新篩選菌種的穩定性完全可以滿足生產的需求。

2.3 篩選菌株發酵大生產驗證

用驗證過的009#、082#和116#菌株各選一支F2 斜面接種子瓶，用于發酵車間125m3發酵罐生產，其平均發酵水平比車間正常生產水平提高了接近15%（見圖1）。

圖1 篩選菌株與車間正常使用菌株發酵生產能力比較（μg/mL）

從圖1 可知，在發酵罐生產中，高產菌株與出發菌株的整個發酵過程前期產量趨勢基本一致，中后期以后發酵能力比原始菌株的優勢開始顯現，平均放罐效價達到47684u/mL，比對照菌株的發酵效價提高了14.7%。經過試驗證明了篩選菌株在發酵能力上穩定可靠，可以作為車間生產菌種使用。

3 結果與討論

紫外誘變和化學誘變作為促進微生物基因突變的一種傳統方法，至今仍是工業微生物育種的重要手段，對微生物發酵行業的發展突破起到了積極作用。有大量報道稱抗生素抗性基因可能與抗生素結構基因和調控基因存在著一定的聯系[10]，抗生素產生菌中的抗性基因與抗生素合成的結構基因緊密連鎖，可發生共突變，即抗性突變總是伴隨著產量突變[11]。

本試驗以MON17042 為出發菌株，經紫外線—氯化鋰雙重復合誘變處理，經過瓊脂塊初篩和搖瓶復篩，獲得3 支高產突變菌株，平均搖瓶效價較對照提高37.6%。對篩選的菌株進行遺傳穩定性試驗表明，所篩選的高產菌株遺傳穩定性強，多次傳代后仍能保持較高的代謝能力。用于發酵車間大生產后，其實際表現與搖瓶表現基本一致，證明生產能力穩定可靠，可應用于工業化生產。