沙苑子苷A對L02細胞脂肪變性模型的降脂作用和機制探討

孟靚 魏益謙 高晶 李麗 邵紫萱 孟智睿 高學敏 王景霞

由于遺傳因素、飲食習慣、生活方式和年齡、絕經、疾病及藥物等原因引起的血清膽固醇或甘油三酯的水平過高或高密度脂蛋白水平過低，稱為血脂代謝異常[1]。脂質代謝異常與許多疾病都密切相關，如動脈粥樣硬化[2]、肥胖癥[3]、胰島素抵抗[4]、高脂血癥[5]、脂肪肝[6]等，因此對血脂代謝異常的防治有著極為重要的意義。沙苑子(SemenAstragaliComplanati)為豆科植物扁莖黃芪(AstragaluscomplanatusR.Br.)的干燥成熟種子，是中醫傳統補陽藥，功能補腎助陽、滋補腎精[7]。藥理研究顯示[8-10]，沙苑子的總黃酮有明顯的調脂作用，能夠降低血清甘油三酯(triglyceride，TG)、膽固醇(cholesterol，TC)水平，沙苑子苷A是含量較高的黃酮類成分之一[11]，本實驗選擇沙苑子苷A為研究對象，采用游離脂肪酸(free fatty acid，FFA)誘導的肝脂肪變L02細胞模型，觀察沙苑子苷A對肝脂質異常的調節作用，并針對TG的合成途徑深入探討沙苑子苷A的降脂機制。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞

正常人肝細胞株L02，購于武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.2 藥物與試劑

沙苑子苷A(美國Apexbio公司，批號：A8425)，高糖DMEM培養基(hyclone，批號：sh30284.01)、胰蛋白酶-EDTA消化液(批號：T4299)、青鏈霉素(批號：V900929)，牛血清白蛋白(批號：V900933)、棕櫚酸鈉(Sodium Palmitate，PA，批號：P9575)、油酸鈉(Sodium Oleate，OA，批號：07501)、二甲基亞礬(Dimethyl sulfoxide，DMSO，批號：C6295)、蛋白裂解液(RIPA，批號：r0278)均購自美國Sigma公司，胎牛血清(美國Gibco公司，批號：10099-141)、CCK8試劑盒(日本同仁化學研究所，批號：CK04)，油紅O細胞染色試劑(北京索萊寶生物公司，批號：g1262)，BCA法蛋白質定量檢測試劑盒(凱基生物公司，批號：KGP902)，TG試劑盒(批號：A110-1-1)、TC試劑盒(批號：A111-1-1)、谷丙轉氨酶(glutamic pyruvic transaminase，ALT)試劑盒(批號：C00902-1)、谷草轉氨酶(Glutamic oxaloacetic transaminase，AST)試劑盒(批號：C010-2-1)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)試劑盒(批號：A020-2-2)、丙二醛(Malondialdehyde，MDA)試劑盒(批號：A003-1-2)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)試劑盒(批號：A001-3-2)均來源于南京建成生物工程研究所；實時熒光定量 PCR 檢測主要實驗材料：引物(北京睿博興科生物技術有限公司合成)，Trizol(美國Invitrogen公司，批號：15596018)，RNase Inhibitor(批號：eo0382)，RNase-free H2O(批號：en0521)均購自美國Fermentas(MBI)公司，轉錄酶、qPCR Mix(APEXBIO，批號：k1070-5000)，固醇調節元件結合蛋白-1c(sterol regulatory element-binding protein 1C，SREBP-1c)抗體(批號：ab133125)、脂肪酸合成酶(fatty acid synthase，FAS)抗體(批號：EPR5700)、過氧化物酶體增殖物激活受體α(peroxisome proliferator activated receptor α，PPARα)抗體(批號：epr18516)、肉毒堿棕櫚酰基轉移酶1A(carnitine palmitoyl transferase 1A，CPT-1A)抗體(批號：ab189182)、抗兔IgG HRP辣根過氧化物酶(批號：ab6721)均購自英國Abcam公司。

1.3 主要儀器與設備

超凈工作臺(青島海爾股份有限公司)，二氧化碳恒溫培養箱(上海一恒科學儀器有限公司)，高速低溫離心機(德國Eppendorf公司)，倒置顯微鏡(德國Leica)，全自動生化分析儀(Rayto)，酶標儀(Thermo)，7500時實定量PCR儀(美國BIO-RAD公司)，電泳儀、轉膜儀(美國Bio-Rad) ，凝膠成像系統(美國 UVP)。

1.4 脂肪變肝細胞模型的建立

1.4.1 CCK8檢測確定FFA濃度范圍 將L02細胞鋪于96孔板中進行培養，待貼壁后，分別加入不同濃度的FFA(OA∶PA為2∶1)，誘導24小時，用CCK8試劑盒測定細胞增殖情況，測出OD值，篩選出FFA濃度范圍。

1.4.2 油紅O染色的細胞形態觀察 油紅O染色可以對肝細胞內的脂滴進行定性觀察，以0.8×105/mL的密度鋪于6孔板中，每孔2 mL，24小時貼壁后加入不同劑量的FFA(OA∶PA為2∶1)作用于L02細胞，培養24小時后，進行染色處理，PBS漂洗2～3遍，4%多聚甲醛固定，光鏡下觀察細胞內脂滴的數量和大小。

1.4.3 細胞內TG的檢測 將L02細胞以1×105/mL種植于24孔板，每孔1 mL，分為對照組和模型組，每組3孔。待細胞貼壁后，加入不同濃度的FFA(OA∶PA為2∶1)干預，培養24小時后，檢測TG含量。

1.5 沙苑子苷A對L02 細胞活力的影響

稱取沙苑子苷 A 溶于 DMSO 中，獲得沙苑子苷 A 儲備液。分裝后放置于-20℃冰箱保存。臨用前用完全培養基稀釋，得到沙苑子苷 A 溶液。經過直徑為 0.22 μm 的一次性針頭濾器，至容積為 15 mL 的經過滅菌處理的離心管中。沙苑子苷 A 溶液終濃度為 1×10-6mM，1×10-5mM，1×10-4mM，1×10-3mM，1×10-2mM，1×10-1mM，1 mM。沙苑子苷 A 溶液中 DMSO 終濃度小于等于0.1%(V/V)。加入貼壁生長的 L02 細胞中，每個濃度設置 3 個重復孔。孵育 24 小時，隨后每孔加入 10μL 的 CCK8 試劑，避光室溫反應 30 分鐘。使用酶標儀 520 nm 波長檢測其 OD 值，計算細胞活力百分率。

1.6 分組與給藥

用完全培養基(含10%胎牛血清的高糖DMEM)傳代培養正常人肝細胞株L02，待細胞呈對數生長是即開始實驗。以0.5×105/mL的密度鋪板種植，將體外培養的肝細胞分為對照組(Control)、模型組(Model)、沙苑子低、中、高劑量組(S-Low 25 μM、S-Middle 50 μM、S-High 100 μM)。對照組：加入完全培養基；模型組：待細胞貼壁后，加入1 mM FFA(1.4.1中確定的造模濃度)孵育24 小時；沙苑子低、中、高劑量組：細胞貼壁后，沙苑子低、中、高劑量先預處理24小時，再加入1 mM FFA干預24小時。然后測定相關指標。

1.7 指標檢測

1.7.1 L02細胞TG、TC、ALT、AST、LDH、MDA含量，SOD活性水平的測定 收集各組細胞，PBS沖洗并1000 r/min離心2～3遍，酶標儀測出相應OD值，同時用BCA蛋白濃度試劑盒檢測蛋白含量。嚴格按照試劑盒說明書，應用全自動生化分析儀檢測。

1.7.2 L02細胞炎性因子IL-6、TNF-α的測定 收集各組細胞，ELISA法檢測白細胞介素-6(interleukin 6,IL-6)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)的含量。

1.7.3 實時熒光定量PCR檢測SREBP-1c、FAS、PPARα、CTP-1A mRNA表達 提取各組細胞總RNA，根據產品說明書操作。用生物分光光度計測定 RNA濃度和純度。取 2 μg RNA 樣本，用逆轉錄試劑盒進行逆轉錄合成 cDNA，并以此為模板進行 PCR 擴增反應。逆轉錄和 PCR反應條件按照試劑盒說明書設置。PCR進行35～40個循環：預變性 95℃，2分鐘；變性95 ℃，30秒；58 ℃退火，30秒 ；72 ℃延伸30秒。以β-actin 為內參，所得 CT 值按照2-△△CT的方法進行均一化處理后再進行統計學分析。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.7.4 蛋白免疫印跡法檢測SREBP-1c、FAS、PPARα、CTP-1A蛋白表達 收集各組細胞，RIPA裂解液裂解細胞，5000 rpm 離心去除沉淀，BCA 法測定蛋白含量，總蛋白50 μg上樣，經10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉移至 NC膜上，用含5%脫脂奶粉的TBST封閉后加入1∶1000稀釋的相應的一抗，4℃搖床孵育過夜，TBST洗3次，加入1∶2000稀釋的辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗，室溫孵育1小時，TBST洗3次后，用Western blot熒光檢測試劑盒顯影、定影。結果用圖象分析儀分析。

1.8 統計學方法

2 結果

2.1 L02細胞脂肪變模型的建立

2.1.1 CCK8法檢測不同濃度FFA對L02細胞活性的影響 分別將0.25 mM、0.5 mM、0.75 mM、1 mM、1.5 mM不同濃度FFA干預L02細胞培養24小時后觀察細胞存活狀況。實驗結果顯示，FFA濃度在1 mM以下時，細胞死亡漂浮較少。CCK8結果顯示，當FFA濃度超過1mM是吸光度顯著降低，細胞增殖影響較大(見表2)。

表2 CCK8檢測不同濃度的FFA對L02細胞活性的影響

2.1.2 油紅O染色觀察不同濃度FFA對L02細胞內脂滴形成的影響 光鏡下觀察可見，對照組細胞邊緣完整，胞漿豐富，細胞內未見紅色脂滴，實驗組隨著游離脂肪酸造模濃度的增加，細胞內脂滴呈遞增趨勢，當FFA濃度大于1mM時，細胞數量明顯減少(見圖1)。

注：A：對照組；B：0.25 mM劑量組；C：0.50 mM劑量組；D：0.75 mM劑量組；E：1.00 mM劑量組；F：1.5 mM劑量組圖1 油紅O染色法觀察細胞內脂滴(油紅O染色，×200)

2.1.3 不同濃度FFA對L02細胞TG含量的影響 當FFA作用濃度為1 mM時，細胞活性及增殖不受大的影響，且在該作用濃度時，細胞內脂滴形成最多、甘油三酯含量最高。而當FFA作用濃度高于1 mM時，細胞的活性與增殖均受到很大影響，且細胞內脂滴與脂質含量減少較多，因此，選擇1 mM作為FFA誘導造模的最佳濃度(見表3)。

表3 不同濃度的FFA對L02甘油三酯水平的影響

以上實驗結果可知，當FFA作用濃度為1 mM時，細胞活性及增殖不受大的影響，且在該作用濃度時，細胞內脂滴形成最多、甘油三酯含量最高。而當FFA作用濃度高于1 mM時，細胞的活性與增殖均受到很大影響，且細胞內脂滴與脂質含量減少較多，因此，選擇1 mM FFA誘導24小時造模成功。

2.2 沙苑子苷A對正常L02細胞活性的影響

CCK-8檢測結果顯示，當沙苑子苷 A 濃度很小時，低濃度的沙苑子苷 A 對 L02 細胞有增強活性的作用，隨著沙苑子苷 A 濃度的升高，細胞活力逐漸與空白對照組相近(見表4)。

表4 CCK8檢測不同濃度沙苑子苷A對L02細胞活性的影響

2.3 沙苑子苷A對脂肪變L02細胞TG、TC、ALT、AST、LDH的影響

與空白對照組比較，模型組L02細胞TG、TC、ALT、AST、LDH含量均明顯增加，差異有統計學意義(P<0.05)；與模型組比較，沙苑子低、中、高劑量組L02細胞TG、ALT、AST、LDH含量均顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)，沙苑子苷A中、高劑量組L02細胞TC含量均顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)(見表5)。

表5 沙苑子苷A對L02細胞內TG、TC、ALT、AST、LDH含量的影響

2.4 沙苑子苷A對脂肪變L02細胞MDA、SOD、IL-6、TNF-α水平的影響

與空白對照組比較，模型組L02細胞MDA、IL-6、TNF-α含量明顯增加，差異有統計學意義(P<0.05)；與模型組比較，沙苑子苷A中、高劑量組L02細胞MDA含量均顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)，沙苑子苷A低、中、高劑量組L02細胞IL-6、TNF-α含量均顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)。與空白對照組比較，模型組L02細胞SOD活力水平明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)；沙苑子低、中、高劑量組L02細胞SOD活力水平均顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05)(見表6)。

表6 沙苑子苷A對L02細胞內MDA、SOD、IL-6、TNF-α含量的影響

2.5 沙苑子苷A對脂肪變L02細胞SPEBP-1c、FAS、PPARα、CPT-1A mRNA表達水平的影響

與對照組比較，模型組L02細胞SPEBP-1c、FAS mRNA的表達均明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)，PPARα mRNA的表達有升高趨勢，但是無統計學意義，CTP-1A mRNA的表達顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)；與模型組比較，沙苑子苷A低、中、高劑量L02細胞FAS、SPEBP-1c mRNA的表達均顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)，沙苑子中、高劑量組L02細胞PPARα、CPT-1A mRNA的表達顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05)(見表7)。

表7 沙苑子苷A對L02細胞SPEBP-1c、FAS、PPARα、CTP-1α mRNA的影響

2.6 沙苑子苷A對脂肪變L02細胞SREBP-1c、FAS、PPARα、CPT-1A蛋白表達水平的影響

與對照組比較，模型組L02細胞SREBP-1c、FAS蛋白表達均明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)，PPARα蛋白的表達有升高趨勢，但是無統計學意義，CPT-1A蛋白的表達顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)；與模型組比較，沙苑子苷A低、中、高劑量L02細胞SREBP-1c、FAS蛋白的表達均顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)，沙苑子中、高劑量組L02細胞PPARα、CPT-1A蛋白的表達顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05)(見表8，圖2)。

表8 沙苑子苷A對L02細胞SREBP-1c、FAS、PPARα、CPT-1A蛋白的影響

注：A:空白對照組；B:1mM游離脂肪酸；C:沙苑子苷A低劑量組；D:沙苑子苷A中劑量組；E:沙苑子苷A高劑量組圖2 甘油三酯代謝相關蛋白免疫印跡圖

3 討論

目前，西醫常用的調脂藥有他汀類、貝特類、膽酸螯合樹脂類、煙酸類及其衍生物等，但都有一定的胃腸道不良反應、頭痛或者肌肉疼痛，嚴重的可出現肝功能損害或橫紋肌溶解癥[12]。黃酮類化合物是一種廣泛存在于自然界中的天然有機化合物，具有較高的安全性和廣泛的生物活性[13]，越來越多的研究顯示黃酮類化合物在調節血脂和預防冠心病方面發揮了重要作用[14]，如：羅布麻葉總黃酮能減輕高血脂導致的血管內皮損傷和改善體內氧化應激水平[15]，山楂葉總黃酮可調控法尼醇受體(farnesoid X receptor，FXR)/ SREBP-1c通路改善非酒精性脂肪肝大鼠肝臟脂質代謝紊亂[16]，還有沙棘總黃酮[17]，銀杏葉總黃酮[18]等等，具有良好的開發和應用前景。沙苑子黃酮是沙苑子中含量較高的一類化合物，目前已經從沙苑子中提取到超過16 種的黃酮類化合物，其中沙苑子苷A是含量較高的黃酮類成分之一[11,19]。目前國內外學者對沙苑子總黃酮的藥理作用研究較多，但是對單體成分的藥理研究還未見報道。本實驗采用FFA誘導 L02 構建肝細胞脂肪變模型，觀察沙苑子苷A對脂肪變L02細胞的影響，探討其降脂作用及分子機制。

肝臟脂肪變的細胞模型較高脂飼養建立的動物模型個體差異較小，可較好的對實驗條件進行把控，其中油酸和棕櫚酸以2∶1比例而成的FFA混合物建立細胞脂肪變模型更符合人體脂肪變的病理過程[20]。本實驗采用CCK8法測定了不同濃度FFA對細胞活性的影響，同時結合油紅O染色光鏡下細胞內脂滴形成情況和定量檢測細胞內TG水平，最終確定1 mM FFA誘導24小時可成功造模。沙苑子苷A干預治療后，能顯著降低L02細胞TG、TC、ALT、AST、LDH含量，同時降低MDA含量、提高SOD活性，降低IL-6、TNF-α的水平，說明沙苑子苷A能減輕脂毒性造成的肝細胞損傷，緩解氧化應激狀態和炎癥反應，提示沙苑子苷A是沙苑子降脂保肝的有效單體成分。

研究表明，TG合成途徑中兩個重要的核受體轉錄因子SPEBP-1c和PPARα對其起關鍵作用。SREBP-1c是脂肪酸和甘油三酯合成中的關鍵分解因子，主要參與肝臟脂肪酸合成和脂肪前體細胞的分化，其過表達會引起與脂質異常相關的疾病如糖尿病、高脂血癥、代謝綜合征的發生[21-22]，可通過調節其下游靶基因FAS、ACC、GPAT的表達來調節肝臟中TG的合成[23]。其中乙酰輔酶A羧化酶(ACC)催化乙酰輔酶A形成丙二酰輔酶A，合成長鏈脂肪酸前體，脂肪酸合成酶(FAS)是一種多功能復合酶，催化乙酰輔酶A和丙二酰輔酶A，參與長鏈脂肪酸生產的內源性蛋白酶[24]，在合成脂肪酸方面發揮著關鍵的作用[25]。GPAT是TG生物合成的限速酶[26]。本實驗結果顯示，給予沙苑子苷A預處理，模型細胞SREBP-1c、FAS mRNA和蛋白的表達量均顯著，表明沙苑子苷A可通過抑制肝臟SREBP-1c的表達，下調肝臟FAS，抑制肝臟中TG的合成。

PPARα是核受體超家族的成員之一，可顯著改善血脂異常和減輕動脈粥樣硬化相關疾病的風險[27]。PPARα激活后與配體形成異二聚體[27]，可調控與脂質代謝相關的多種基因編碼的蛋白質，如脂肪酸轉位酶、乙酰輔酶A氧化酶等[28]，從而介導TG和脂肪酸的代謝分解。CPT-1A是線粒體內脂肪酸β氧化途徑的限速酶[29]，其作用是將長鏈脂肪酸從胞漿轉運如線粒體內部，進行β氧化[30]。本實驗結果顯示，給予沙苑子苷A預處理，模型細胞PPARα、CPT-1A mRNA和蛋白表達量均顯著升高，說明沙苑子苷A通過上調肝臟PPARα的表達水平，提高CPT-1A的活性，加速了脂肪酸的β氧化分解，進而使TG的合成減少。

綜上所述，沙苑子苷A對脂肪變性L02肝細胞模型具有良好的降脂和保肝作用，其降脂機制可能是沙苑子苷A通過抑制肝細胞SREBP-1c的表達，降低TG合成途徑中限速酶FAS水平，降低TG合成速度；同時上調PPARα蛋白表達，提高脂肪酸β氧化途徑中CPT-1A水平，加速脂肪酸的β氧化，減少TG合成，從兩方面共同作用從而達到降脂和保肝效果。