四種清熱解毒類中草藥對廣泛耐藥鮑曼不動桿菌的體外抑菌比較

馬冬梅 陶慶春 蔣東葵 李世亮

鮑曼不動桿菌，是臨床檢出率較高的病原菌，隨著抗生素的大量使用，近些年來鮑曼不動桿菌耐藥率較高，其中廣泛耐藥株的檢出率也呈不斷上升趨勢[1-4]。本次試驗采用微量肉湯稀釋法測定板藍根、魚腥草、金銀花、連翹單用以及與頭孢哌酮/舒巴坦聯用對30株臨床分離廣泛耐藥鮑曼不動桿菌的最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration，MIC)，分析比較不同中草藥與頭孢哌酮/舒巴坦聯合的抑菌作用，為治療廣泛耐藥鮑曼不動桿菌感染提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 標本來源

自2018年9月12日至2019年10月19日收集北京中醫藥大學第三附屬醫院臨床分離的廣泛耐藥鮑曼不動桿菌，藥敏結果遵照CLSI M100-S28執行，選出30株廣泛耐藥株(排除同一病人重復株)，質控菌株：大腸埃希氏菌ATCC25922。

1.2 培養基

伊紅美蘭平板(OXOID公司)、血平板(OXOID公司)、麥康凱選擇平板(OXOID公司)、M-H肉湯培養基(OXOID公司)、M-H瓊脂培養基(OXOID公司)。

1.3 試驗藥物

板藍根顆粒(北京康仁堂藥業有限公司，批號:20191105)、魚腥草顆粒(北京康仁堂藥業有限公司，批號:20191028)、金銀花顆粒(北京康仁堂藥業有限公司，批號:20191113)、連翹顆粒(北京康仁堂藥業有限公司，批號:20191010)，頭孢哌酮/舒巴坦(頭孢哌酮/舒巴坦2∶1，輝瑞制藥，批號：1847364)。

1.4 儀器設備

自動微生物鑒定藥敏分析儀(BD公司Phoenix100)、比濁儀(BD公司)、電子分析天平(賽多利斯)、電熱恒溫培養箱(北京科偉醫療器械廠)、200 uL微量加樣器、96孔板。

1.5 試驗菌液配制

分別取鑒定分純的30株廣泛耐藥鮑曼不動桿菌菌落，溶于生理鹽水用比濁儀校正濃度至0.5麥氏比濁，再用MH肉湯稀釋100倍備用(相當于細菌數1×106CFU/mL的菌液)。

1.6 最低抑菌濃度測定

分別配置板藍根、魚腥草、金銀花、連翹原始藥液，濃度為500 mg/mL，取無菌的96孔板，采用微量肉湯稀釋法分別將原始藥液用MH肉湯依次對倍稀釋加入第1至第10孔，每孔加藥液100 μL，各組藥物配制濃度范圍為250 mg/mL～0.5 mg/mL，然后每孔加入試驗菌液100 μL，同時做空白和陽性對照，35℃培養24小時，測定各藥物對30株菌的最低抑菌濃度(MIC)。配制頭孢哌酮/舒巴坦原始藥液濃度1024 μg/mL，其它操作步驟同上，測定頭孢哌酮/舒巴坦對30株菌的MIC。

1.7 聯合用藥試驗

根據30株廣泛耐藥鮑曼不動桿菌對板藍根、魚腥草、金銀花、連翹、頭孢哌酮/舒巴坦的MIC結果，分別取2倍MIC為最高稀釋濃度，按倍比稀釋各自配制8個稀釋濃度，將配好的不同濃度的板藍根、魚腥草、金銀花、連翹分別與頭孢哌酮/舒巴坦各50 μL，按棋盤法設計兩兩混合組合加入96孔板，再分別加入30株試驗菌液100 μL，35℃培養24小時。選擇上述30組棋盤模型中兩藥聯合最佳組合效應時的MIC值，記錄并計算部分抑菌濃度(fraction inhibitory concentration，FIC)指數。

1.8 結果判讀

FIC指數=甲藥聯合的MIC/甲藥單用的MIC+乙藥聯合的MIC/乙藥單用的MIC，計算FIC指數。FIC指數≤0.5為協同作用，0.52為拮抗作用。

2 結果

2.1 各組中藥的MIC結果

板藍根、魚腥草、金銀花、連翹與頭孢哌酮/舒巴坦單用和聯用對30株廣泛耐藥鮑曼不動桿菌的藥物最低抑菌濃度MIC值、MIC50、MIC90，結果分別見表1、表2、表3、表4。4種中草藥對廣泛耐藥鮑曼不動桿菌均具有一定的抑菌作用，其中魚腥草的MIC值最高、連翹的MIC值最低，連翹的體外抑菌效果明顯好于其他3種。聯合用藥抑菌效果來看，板藍根、魚腥草與頭孢哌酮/舒巴坦聯合用藥，MIC值比單獨用藥有明顯降低；金銀花與頭孢哌酮/舒巴坦聯合用藥，金銀花MIC值范圍的最大值略有升高、頭孢哌酮/舒巴坦MIC值范圍有所降低，兩者MIC50、MIC90與均沒有變化；連翹與頭孢哌酮/舒巴坦聯合用藥，MIC50、MIC90與單獨用藥相比反而升高了。

表2 魚腥草、頭孢哌酮/舒巴坦(SCF)單用以及聯用對廣泛耐藥鮑曼不動桿菌的MIC值范圍

表3 金銀花、頭孢哌酮/舒巴坦(SCF)單用以及聯用對廣泛耐藥鮑曼不動桿菌的MIC值范圍

表4 連翹、頭孢哌酮/舒巴坦(SCF)單用以及聯用對廣泛耐藥鮑曼不動桿菌的MIC值范圍

2.2 濃度—累積抑菌百分率曲線

頭孢哌酮/舒巴坦(SCF)單用和與板藍根(BLG)、魚腥草(YXC)、金銀花(JYH)、連翹(LQ)聯用濃度—累積抑菌百分率。結果見表5、圖1。圖1顯示，頭孢哌酮/舒巴坦與板藍根、魚腥草、金銀花聯合應用與單用相比，曲線在一定范圍內左移，表明頭孢哌酮/舒巴坦與板藍根、魚腥草、金銀花聯用比單用MIC值在一定范圍內有所降低，尤其與板藍根聯用，曲線左移明顯，聯合抑菌效果較好；頭孢哌酮/舒巴坦與連翹聯合應用與單用相比，濃度—累積抑菌百分率曲線一定范圍內明顯右移，兩藥聯用比單用MIC值在一定范圍內有所升高。

圖1 頭孢哌酮/舒巴坦單用和聯用濃度—累計抑菌率

表5 頭孢哌酮/舒巴坦(SCF)單用和聯用濃度-累積抑菌百分率

2.3 FIC指數分布

板藍根等與頭孢哌酮/舒巴坦聯合應用對廣泛耐藥鮑曼不動桿菌FIC指數分布。結果見表6。板藍根與頭孢哌酮/舒巴坦聯用FIC指數：FIC≤0.5為26.7%，0.52為0%；魚腥草與頭孢哌酮/舒巴坦聯用FIC指數：FIC≤0.5為26.7%，0.52為0%；金銀花與頭孢哌酮/舒巴坦聯用FIC指數：FIC≤0.5為0%，0.52為20%；連翹與頭孢哌酮/舒巴坦聯用FIC指數：FIC≤0.5為0%，0.52為73.3%。

表6 板藍根等與頭孢哌酮/舒巴坦(SCF)聯合應用FIC指數分布

3 討論

近年來，鮑曼不動桿菌的檢出率和耐藥率都呈現較高水平，高耐藥率和復雜的耐藥機制[5-6]嚴重影響臨床療效。鮑曼不動桿菌感染診治專家共識指出：耐藥菌株根據藥敏可以選用頭孢哌酮/舒巴坦、氨芐西林/舒巴坦或碳青霉烯類，聯合應用其他類抗菌藥物治療[7]，有相關研究表明聯合應用兩種抗菌藥物對多重耐藥鮑曼不動桿菌表現較好的抗菌活性[8]。

中藥作為中國傳統醫學的重要部分，具有資源豐富、副作用小、不易產生耐藥性等特點，越來越顯示出獨特優勢被廣泛應用于臨床。板藍根、魚腥草、金銀花、連翹這幾味常用中草藥，在清熱解毒抗感染治療中發揮著重要作用。頭孢哌酮/舒巴坦有研究表明抗菌活性較好[9-11]，在全國細菌耐藥檢測數據顯示對鮑曼不動桿菌耐藥率較低。中藥的抗菌作用以及與抗生素聯合應用越來越受研究關注，也在臨床廣泛應用。趙英妹等[12]分析了8種中草藥對臨床常見菌株的體外抑菌活性，結果顯示黃連、金銀花、野菊花、連翹和大黃對金黃色葡萄球菌、有較強的抑菌作用；黃連和金銀花對大腸埃希菌也有一定的抑菌作用。高貴陽等[13]研究發現魚腥草、連翹、黃芩對銅綠假單胞菌有一定抗菌活性。張國祖等[14]將連翹與頭孢噻呋聯合應用，發現對耐藥大腸埃希氏菌聯合抑菌效果以協同作用為主，與恩諾沙星聯用時以拮抗作用為主。賈芳等[15]做了魚腥草素鈉和氨芐西林對表皮葡萄球菌的聯合試驗，結果顯示聯合應用與單獨應用相比MIC明顯降低，FIC指數顯示均為協同作用。

本次試驗藥物結果顯示：板藍根、魚腥草、金銀花、連翹單獨應用對廣泛耐藥鮑曼不動桿菌均具有一定的抑菌作用，其中連翹的MIC值最低，抑菌效果明顯好于其他三種。不同中草藥與頭孢哌酮/舒巴坦聯合應用也表現出了不同的抑菌效果，其中板藍根與頭孢哌酮/舒巴坦聯合抑菌效果最好。中藥通過損傷細菌細胞膜、抑制細菌的外排泵、干擾細菌組分合成等[16-18]因素實現抗菌活性，但具體抑菌機制，還需進一步研究。此外本次實驗采用體外抑菌試驗，在體內的抑菌效果如何也有待進一步驗證。