股骨頭和血清LncRNA HOTAIR表達與非創傷性股骨頭壞死進展的相關性

劉偉樂，鄭少偉，黎 旭，王 胤，孫春漢，謝福杰，鐘浩博

1惠州市第一人民醫院骨科，廣東 惠州 516000；2廣東醫科大學，廣東 湛江 524023

股骨頭壞死（ONFH）是一種由凝血、纖溶系統紊亂和血液供應不足引起的骨質破壞性疾病，通常會導致進行性股骨頭塌陷和繼發性關節炎，需要進行保髖手術，或更嚴重者需全髖關節置換術［1］。ONFH可分為創傷型和非創傷型。作為ONFH的一個亞型，非創傷性ONFH常發生在皮質類固醇治療炎癥性疾病以及濫用酒精等情況之后［2］。據報道，非創傷性ONFH的發生和發展與多種因素密切相關，包括人類免疫缺陷病毒感染、自身免疫性疾病、酗酒、使用糖皮質激素和凝血障礙［3］。但迄今為止該病的發病機制尚未完全清楚。

非編碼RNA是編碼人類基因組蛋白質產物的信使RNA（mRNA）轉錄出的大量沒有蛋白質編碼能力的RNA［4］。近年來發現的長鏈非編碼RNA（LncRNA）是一類由200個以上核苷酸組成的非編碼RNA亞群，在正常人體生理和病理過程中起到了重要作用［4］。近年來發現一些LncRNA在ONFH病理過程中發揮了重要的調控作用，如HOX轉錄反義RNA（HOTAIR）是一個最早于2007年發現的LncRNA，已被證明與多種癌癥、心血管疾病以及帕金森病的等進展密切相關［5-7］。但目前為止還未有研究探討HOTAIR在與非創傷性ONFH進展的相關性。本研究擬測定股骨頭局部以及血清HOTAIR表達，探討其是否與非創傷性疾病嚴重程度呈正相關。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2018 年1 月～2020 年1 月我院收治的90 例ONFH患者。所有患者均接受全髖關節置換或保髖手術(包括髓核減壓術、帶血管骨移植、股內翻截骨術和股骨旋轉截骨術)治療。ONFH的診斷、分類和分期參考2001年日本骨科協會制定的標準［8］。納入標準：根據X線、MRI和CT掃描診斷為ONFH；激素性ONFH患者在1年內平均服用16.6 mg/d或等效最大劑量80 mg/d潑尼松龍；酒精相關性ONFH患者的酒精攝入量大于400 mL/周（320 g/周），持續6月以上。排除標準：不符合激素性或酒精性ONFH診斷標準；排除外傷性ONFH、髖關節脫位或其他髖關節疾??；有Paget病、腎性骨營養不良、甲狀旁腺功能亢進、甲狀旁腺功能減退或骨轉移病史。同時，選取84名年齡和性別分布相似的在我院進行健康體檢人群作為對照組，排除ONFH 患者和其它疾病。ONFH組患者男50例，女40例，年齡30～67歲（48.3±7.9歲），病程1～12.5年（5.8±2.1年）；對照組男46例，女38例，年齡27～70歲（49.1±6.6歲）。所有參與者都簽署了知情同意書，本研究獲我院倫理委員會批準。

1.2 組織和血清樣本檢測

在進行手術前，從患者身上采集靜脈血樣本（空腹狀態）。采血后4 h內處理所有血清標本。1500 g離心15 min后分離得到血清。從患者中獲得90例壞死組織和鄰近的非壞死組織。根據試劑盒說明，使用帶有gDNA的PrimeScript RT試劑盒（TaKaRa）將總RNA反向轉錄到cDNA，使用FastStart Universal SYBR Green Master（ROX）（Roche，Basel，Germany）進 行qRTPCR。將數據標準化為GAPDH的表達，并用2-△△Ct法分析各基因的相對表達水平。所有實驗重復3次。本研究中使用的引物序列如下：HOTAIR：正向：5'-AGCCCTAGCCTTTGGAAGCT-3'；反向：5'-ACCCAT GTGTCTCAAGATGCATT-3'；GAPDH：正向：5'-ACCA CAGTCCATGCCATCAC-3'；反向：5'-TCCACCACCCT GTTGCTGTA-3'。

1.3 影像學進展分級

應用國際骨循環研究學會（ARCO）分類系統對ONFH患者的影像學進展進行研究，ARCO分級依靠多種影像學手段對ONFH壞死的嚴重程度進行評判，具體分為5個階段（0～4級）。0級：X射線、CT或MRI上沒有任何變化；1級：X射線和CT未發現異常，但MRI掃描均為異常；2級：早期的X線改變，出現硬化等，但未見到新月征，軟骨下骨的完整性尚未受到損害；3級：有早期骨折（新月征）和股骨頭變平的影像學證據；4級：關節間隙變窄和破壞，表明骨關節炎存在［9］。

1.4 癥狀嚴重程度評估

采用視覺模擬量表（VAS）和Harris髖關節評分確定ONFH的癥狀嚴重程度。VAS評分用于評估疼痛程度，其范圍從0到10，0表示完全沒有疼痛，10表示極度疼痛［10］。Harris髖關節評分是一種基于臨床醫生的工具，用于測量全髖關節置換術后的結果，也常用于評估包括ONFH在內的髖關節相關疾病的功能能力［11］。

1.5 統計學分析

采用SPSS20.0軟件對數據進行統計分析。定量數據以均數±標準差或中位數（四分位數間距）表示，以Kolmogorov-Smirnov檢驗數據正態分布。采用單因素方差分析比較不同ARCO分級患者的HOTAIR水平，Bartlett 檢驗用于檢驗組間方差的均一性，隨后進行Tukey或Tahmane事后檢驗，應用Pearson或Spearman分析HOTAIR水平與疾病嚴重程度之間的相關性。以P<0.05為差異有統計學意義。

圖1 ARCO分期1～4期X線股骨頭壞死改變Fig.1 X-ray changes of ONFH in ARCO stage 1-4.

2 結果

2.1 患者臨床資料

90例ONFH患者中包括激素型ONFH 48例，酒精型ONFH 42例。激素型ONFH和酒精型ONFH患者血清和局部HOTAIR表達差異無統計學意義（P>0.05，圖2A），ONFH患者血清HOTAIR相對表達高于正常對照組（1.97±0.32vs1.00±0.10，P<0.001，圖2B)，此外壞死組織HOTAIR相對表達顯著高于非壞死組織中的表達(2.37±0.25vs1.00±0.10，P<0.001，圖2C）。

圖2 HOTAIR在ONFH患者中的表達水平Fig.2 HOTAIR expressions in ONFH patients.

2.2 血清和局部HOTAIR表達與ARCO分級的關系

90例不同程度的非創傷性ONFH患者的血清和局部HOTAIR表達情況（表2）。據此，根據ARCO分級系統將ONFH患者分為3組。ONFH組30例為ARCO 1/2級，30例為ARCO 3級，30例為ARCO 4級。ARCO 4級的ONFH 患者血清HOTAIR 表達高于3 級（2.22±0.28vs1.94±0.36，P=0.001，圖3A）。ARCO 3 級的ONFH患者與ARCO 1/2級相比，血清HOTAIR表達升高（1.94 ± 0.36vs1.73 ± 0.23，P=0.009，圖3A）。Spearman 相關分析顯示，血清中HOTAIR 的表達與ARCO分級呈顯著正相關（r=0.569，P<0.001，圖3C）。

另一方面，ARCO 4 級的ONFH 患者的局部HOTAIR表達明顯高于3級ARCO患者（2.58±0.22vs2.42±0.32，P=0.020，圖2B）。ARCO3級的ONFH患者與1/2 級患者相比，HOTAIR 的局部表達顯著升高（2.42±0.32vs2.13±0.24，P<0.001，圖3B）。Spearman相關分析顯示，局部HOTAIR表達與ARCO分級呈顯著正相關（r=0.585，P<0.001，圖3D）。

圖3 血清與局部HOTAIR在不同ARCO分期時期的表達程度Fig.3 Serum and local HOTAIR expressions among different ACRO stages.

2.3 血清和局部HOTAIR表達與臨床嚴重程度的關系

血清和局部HOTAIR表達與VAS和HSS評分確定的臨床嚴重程度的相關性分析顯示，血清和局部HOTAIR表達與VAS評分呈正相關（血清r=0.557，P<0.001；局部r=0.672，P<0.001，圖4A、C），血清和局部HOTAIR的表達與HSS評分呈負相關（血清r=-0.326，P=0.002；局部r=-0.489，P<0.001，圖4B、D）。

圖4 ONFH患者血清與局部HOTAIR表達與臨床癥狀嚴重的相關性Fig.4 Correlation of serum and local HOTAIR expressions with clinical severity in ONFH patients.

2.4 ROC曲線分析

在ARCO 1/2vsARCO 3 期，AUC=0.663（P=0.03，圖5A）；ARCO 3vsARCO 4期，AUC=0.726（P=0.003，圖5B）。

圖5 血清HOTAIR水平的ROC曲線分析Fig.5 A ROC curve analysis of HOTAIR expressions.

3 討論

本研究首次探討了股骨頭和血清LncRNA HOTAIR表達與非創傷性股骨頭壞死進展的相關性。結果發現非創傷性ONFH患者血清HOTAIR表達顯著高于健康對照組，ONFH組織中的局部HOTAIR在壞死區明顯高于非壞死區。與ARCO 1/2級相比，ARCO 3級血清和局部HOTAIR表達顯著升高；與ARCO 3級相比，ARCO 4級的血清和局部HOTAIR表達顯著升高。血清和局部HOTAIR表達與ARCO分級呈正相關性，與VAS評分呈顯著正相關，與Harris髖關節評分呈負相關。進一步ROC曲線分析表明，血清HOTAIR可作為診斷非創傷性ONFH影像學進展的良好指標，表明非創傷性ONFH患者血清和局部HOTAIR表達升高可能反映ONFH病情的嚴重程度。

到目前為止，非外傷性ONFH大多是根據影像學表現以及疼痛和功能受損的主訴來診斷的［12］。然而，影像學改變包括囊性或硬化性改變、軟骨下塌陷和關節間隙狹窄幾乎是中晚期的征象［13］。此外，還有目前臨床上還沒有明確的手段來監測非創傷性ONFH的進展及手術或藥物治療的療效，因此迫切需要更有效、可靠、定量的方法來監測早期非創傷性ONFH 的進展及治療效果。生物標志物是預測疾病預后和評價治療效果的有效工具，近年來新型可靠的生物標志物的應用得到了廣泛的應用。對于非創傷性ONFH，血清生物標記物分析可作為臨床相關方法，在X線顯示骨壞死跡象之前監測ONFH的進展［14］。

LncRNA是另一種可以作為疾病診斷標記物循環標志物的RNA分子，其長度大于200 bp的轉錄物，沒有或幾乎沒有翻譯潛能。它們在表觀遺傳學、轉錄和轉錄后水平上沉默或增強近端基因的表達［15］。本研究發現LncRNA HOTAIR在非創傷性ONFH患者中表達升高，表明其在該病中具有重要的作用進展。骨代謝紊亂和供血不足是ONFH的關鍵步驟。HOTAIR 在前期的一項芯片分析中發現，激素型ONFH組的HOTAIR表達水平顯著高于正常對照組［16］；另一研究發現HOTAIR可靶向miR-17-5p抑制非創傷性調節ONFH成骨分化和增殖［17］。HOTAIR通過抑制VEGFA的表達抑制人胎盤血管生成［18］，也下調miR-126/SCEL通路促進燒傷創面血管生成［19］，而通過抑制HOTAIR的組蛋白修飾可以抑制激素性ONFH的進展［20］。上述研究結合本研究表明HOTAIR可以抑制血管生成，抑制成骨，可能在非創傷性ONFH的進展中起到了重要作用。

本研究仍然有一些局限性。首先，本研究沒有包括對生物學功能的深入分析，這對于闡明HOTAIR在非創傷性ONFH中的作用至關重要。其次，本研究是一項橫斷面研究，樣本量相對較小，可能會影響目前的研究結果。盡管我們獲得了HOTAIR與ONFH疾病進展之間的關聯的證據，但非創傷性ONFH的發病機制仍不完全清楚。

綜上，本研究首次報道了非創傷性ONFH患者中HOTAIR的異常表達，非創傷性ONFH患者血清和局部HOTAIR表達升高與疾病嚴重程度相關，這也為認識本病的發病機制、早期診斷和指導治療提供了新的思路。