進展期直腸癌新輔助放化療療效評估模型的建立及評價：基于MRI和網狀蛋白1C

董 健，李垣婕，謝宗源，程 亮，李 興，趙振偉

1開灤總醫院林西醫院普外科，河北 唐山 063100；2華北理工大學附屬醫院磁共振室，河北 唐山 063000

直腸癌是常見的消化道腫瘤之一，我國的直腸癌發病率和死亡率逐年升高［1］。由于直腸癌早期癥狀隱匿，多數患者就診時已處于局部進展期［2］。目前，對于局部進展期直腸癌的治療主要采取新輔助放化療后全直腸系膜切除術方案治療。新輔助放化療可使腫瘤降期，提高腫瘤局部控制率，降低復發率，新輔助放化療后病理學完全緩解與直腸癌預后良好密切相關［3］。但病理學完全緩解受個體差異影響較大，對放化療不敏感的患者接受新輔助放化療后弊大于利［4-5］。目前，臨床多采用影像學手段評價直腸癌新輔助放化療療效，但由于新輔助化療會造成直腸癌和周圍組織纖維化，致使現有影像學手段評價腫瘤再分期的準確率降低［6］。因此，探究預測新輔助放化療療效的指標或模型有著重要意義。

自噬在腫瘤發生、發展過程中發揮著重要作用，其可調節腫瘤細胞對放化療的敏感性［7］。網狀蛋白1C（RTN-1C）可調節細胞自噬程度，干擾其表達可抑制細胞自噬［8］。此外，RTN-1C還可通過調節內質網應激誘導免疫原性細胞死亡，從而提高抗癌免疫能力［9］。因此有理由認為RTN-1C 與直腸癌新輔助放化療療效有關。本課題組前期研究結果顯示MRI相關參數，包括容積轉運常數（Ktrans）、血管外細胞外間隙容積比（Ve）、回流速率常數（Kep）和表觀彌散系數（ADC）可評估進展期直腸癌新輔助放化療療效［10］。但目前鮮有研究分析RTN-1C與進展期直腸癌新輔助放化療療效的關系，且關于分子標志物與影像學參數結合的模型用于進展期直腸癌新輔助放化療療效評估也少有報道。本研究主要分析RTN-1C與進展期直腸癌新輔助放化療療效的關系，構建基于MRI和RTN-1C的進展期直腸癌新輔助放化療療效評估模型并評價該模型的效能，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取2018年8月～2020年11月在開灤總醫院林西醫院就診的134例進展期直腸癌患者作為研究對象。進展期直腸癌診斷參照《中國結直腸癌診療規范（2020年版）》［11］。納入標準：經結直腸鏡病理檢查確診為直腸癌；經MRI檢查未發現遠處轉移，確診為進展期直腸癌；首次確診并接受新輔助放化療；新輔助化療前未接受抗腫瘤治療。排除標準：臨床資料不完整；不配合完成研究所需檢查項目；合并其他惡性腫瘤；伴血液系統疾病或免疫性疾病等；未簽署知情同意書。134例患者中，男性87例，女性47例，年齡27～70（51.65±9.89）歲；T3期92例，T4期42例；N0期78例，N1期36例，N2期20例。本研究符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》，經開灤總醫院林西醫院醫學倫理委員會批準。

1.2 新輔助放化療方案

給予受試者新輔助放化療方案進行干預。放療方案：放療劑量為50 Gy，2 Gy/次，連續放療5次/周，持續5周，共計25次。化療方案：化療與放療同步，采用氟尿嘧啶單藥化療，靜脈滴注，給藥劑量為400 mg/m2，1次/d，給藥7 d/周，直至放療結束。于新輔助放化療干預8周后行全直腸系膜切除術。

1.3 新輔助放化療療效評價

全直腸系膜切除術后根據腫瘤病灶的病理反應評價新輔助放化療療效，評價標準參照《NCCN直腸癌腫瘤臨床實踐指南》［12］。由副主任醫師或以上級別的病理科醫生進行評定，無存活的腫瘤細胞，即為完全消退，定義為病理學完全緩解。根據是否達到病理學完全緩解將其分為2組：完全緩解組（n=39）和未完全緩解組（n=95）。

1.4 外周血單個核細胞中RTN-1C表達量檢測

1.4.1 外周血中單個核細胞的分離 抽取受試者新輔助放化療前1周內的空腹肘部靜脈血10 mL。用Ficoll密度梯度分離法［13］獲取外周血中單個核細胞，步驟如下：用PBS溶液稀釋血液，并將稀釋液導入Ficoll分離液中，低溫離心（2000 r/min）20 min，吸取PBMC 層，用PBS溶液重懸細胞，低溫離心（1500 r/min）10 min，重復上述操作2次，即可獲取單個核細胞。

1.4.2 RTN-1C表達量檢測 用蛋白質免疫印跡法［14］檢測單個核細胞中RTN-1C表達量，步驟如下：用RIPA裂解細胞，用BCA法定量蛋白，用10% SDS-PAGE分離膠電泳，升壓至120 V至溴酚藍跑出膠面，轉膜，用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，滴加兔抗人RTN-1C單克隆抗體（1∶1000），4 ℃孵育過夜，滴加山羊抗兔二抗（1∶5000），室溫下孵育1 h，ELC曝光顯影。用Image J軟件讀取實驗圖像。

1.5 MRI檢查及參數獲取

所有受試者均于新輔助放化療前1 周內行盆腔MRI檢查。應用西門子Skyra 3.0 T MRI掃描儀，體部相控陣18通道線圈，行盆腔MRI常規平掃，包括矢狀位、冠狀位、軸位T2WI、軸位T1WI序列，擴散加權成像（DWI）（b=0，1000 s/mm2）和動態對比增強磁共振成像（DCE-MRI）軸位序列（應用T1 VIBE序列，共采集35期，8 s/期，于第3期借助高壓注射器經肘部靜脈注射對比劑釓雙胺，0.1 mmol/L，流率控制3.0 mL/s，此后，以相同流率注射生理鹽水15 mL）。在DCE-MRI偽彩圖上測量DCE-MRI 定量灌注參數，包括Ktrans、Ve和Kep。在ADC圖上測量ADC值。

1.6 統計學分析

用SPSS23.0版軟件包進行統計分析。正態分布的計量資料用均數±標準差表示，組間比較用獨立樣本t檢驗。計數資料以n（%）表示，組間比較用χ2檢驗。用Logistic回歸分析進展期直腸癌新輔助放化療療效的風險因素，并構建上述風險因素的列線圖回歸模型。用ROC曲線評估模型的區分度，用校準曲線評價模型校準度，用決策曲線分析法評價模型臨床實用價值。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組臨床特征比較

完全緩解組和未完全緩解組的年齡、性別構成、T分期構成和N分期構成比較，差異均無統計學意義（P>0.05，表1）。

表1 2組的臨床特征比較Tab.1 Comparison of clinical features between the two groups

2.2 兩組RTN-1C相對表達量比較

完全緩解組的RTN-1C相對表達量高于未完全緩解組，差異有統計學意義（0.93±0.13vs0.76±0.12,t=7.313，P<0.001，圖1）。

圖1 兩組的RTN-1C相對表達量比較Fig.1 Comparison of the relative expression levels of RTN-1C in the two groups.

2.3 兩組Ktrans、Ve、Kep和ADC值比較

完全緩解組的Ktrans值、Ve值和Kep值均高于未完全緩解組，ADC值低于未完全緩解組，差異均有統計學意義（P<0.05，表2）。

表2 兩組的Ktrans、Ve、Kep和ADC值比較Tab.2 Comparison of Ktrans,Ve,Kep and ADC values of the two groups(Mean±SD)

2.4 進展期直腸癌新輔助放化療療效的Logistic回歸分析

將進展期直腸癌新輔助放化療療效作為因變量，將T分期、N分期、Ktrans值、Ve值、Kep值、ADC值和RTN-1C相對表達量作為自變量，納入多因素Logistic回歸分析，結果顯示T4期和高ADC值是進展期直腸癌新輔助放化療療效獨立危險因素（P<0.05），高Ktrans值、高Ve值和高RTN-1C相對表達量是進展期直腸癌新輔助放化療療效的獨立保護因素（P<0.05，表3）。

表3 進展期直腸癌新輔助放化療療效的Logistic回歸分析Tab.3 Logistic regression analysis of neoadjuvant radiotherapy and chemotherapy efficacy in advanced rectal cancer

2.5 模型建立及評價

構建T分期、Ktrans值、Ve值、ADC值和RTN-1C相對表達量評價進展期直腸癌新輔助放化療療效的列線圖回歸模型（模型A，圖2A）；構建T分期、Ktrans值、Ve值和ADC值評價進展期直腸癌新輔助放化療療效的列線圖回歸模型（模型B，圖2B）。模型A評價進展期直腸癌新輔助放化療療效的ROC曲線下面積、最佳截斷點、敏感度和特異度分別為0.965（95%CI：0.936～0.993）、0.59、96.8%和87.2%；模型B評價進展期直腸癌新輔助放化療療效的ROC曲線下面積、最佳截斷點、敏感度和特異度分別為0.957（95%CI：0.922～0.992）、0.75、88.4%和92.3%。模型A評價進展期直腸癌新輔助放化療療效的ROC曲線下面積高于模型B，但差異無統計學意義（Z=1.155，P=0.248，圖2C）。模型A和模型B的校準曲線均與理想曲線重合度較高（圖2D、2E）。當閾值概率在0.39%～0.42%，0.75%～0.80%和0.86%～0.88%時，模型B評價進展期直腸癌新輔助放化療療效的凈收益高于模型A；當閾值概率在其他范圍時，模型A評價進展期直腸癌新輔助放化療療效的凈收益高于模型B（圖2F）。

圖2 列線圖模型及評價Fig.2 Nomogram model and evaluation.

3 討論

新輔助放化療治療進展期直腸癌的總體有效率在80%左右［15］。對于放化療敏感的進展期直腸癌患者，若在新輔助放化療后達到病理學完全緩解，接受全直腸系膜切除術后將極大的改善預后；但對于原發性放化療抵抗的進展期直腸癌患者，若給予新輔助放化療后發生腫瘤進展，將延誤治療時機。因此，對新輔助放化療療效進行精準預判，將極大的改善進展期直腸癌預后［16］。目前，鮮有研究構建基于MRI或RTN-1C的模型用于進展期直腸癌新輔助放化療療效評估。本研究主要分析MRI相關參數和RTN-1C與進展期直腸癌新輔助放化療療效的關系，并構建基于MRI和RTN-1C的療效評估模型，驗證模型價值。

本研究結果顯示完全緩解組的RTN-1C相對表達量高于未完全緩解組，該結果提示RTN-1C與進展期直腸癌新輔助放化療病理學完全緩解有關，或可用于評估新輔助放化療療效。目前，關于Ktrans值、Ve值和Kep值與進展期直腸癌新輔助放化療療效的報道較少。有學者指出直腸癌新輔助化療后病灶的Ktrans值降低，病理學完全緩解的Ktrans值降低更為明顯；此外，新輔助化療前Ktrans值高者療效更好［17］。有研究證實直腸癌病理學完全緩解組的新輔助化療前ADC值低于未病理學完全緩解組［18］。本研究結果顯示完全緩解組的Ktrans值、Ve值和Kep值均高于未完全緩解組，ADC值低于未完全緩解組，該結果提示Ktrans值、Ve值、Kep值、ADC值與進展期直腸癌新輔助放化療病理學完全緩解有關，或可用于評估新輔助放化療療效。

本研究用Logistic 回歸分析了T 分期、Ktrans值、Ve值、Kep值、ADC值和RTN-1C相對表達量與進展期直腸癌新輔助放化療療效的關系，結果顯示T4期和高ADC值是進展期直腸癌新輔助放化療療效獨立危險因素，高Ktrans值、高Ve值和高RTN-1C相對表達量是進展期直腸癌新輔助放化療療效的獨立保護因素。本研究結果顯示RTN-1C與新輔助放化療療效有關，推測其機制是直腸癌患者RTN-1C表達量升高，促使自噬過度，腫瘤細胞死亡［8］；此外，RTN-1C表達量升高可調節內質網應激加速免疫原性細胞死亡，提高抗癌免疫能力［9］，RTN-1C表達量與上述過程密切相關，進而反映新輔助放化療療效。目前，關于ADC值與進展期直腸癌新輔助放化療療效的關系仍存在爭議。有研究認為直腸癌放化療前的ADC值與病理學完全緩解無關，不存在預測價值［19-20］，該結果與本研究結果相悖，其差異可能與地域、人種及樣本量等有關，還需開展大樣本、多中心研究予以驗證。

本研究構建了基于MRI和RTN-1C的模型A，與基于MRI的模型B比較，二者的區分度和校準度差異均無統計學意義，但決策曲線分析結果顯示當閾值概率在0.39%～0.42%、0.75%～0.80%、0.86%～0.88%時，模型B評價進展期直腸癌新輔助放化療療效的凈收益高于模型A，但高出程度有限。因此，在上述閾值概率范圍內，認為兩模型臨床應用價值相當。當閾值概率在其他范圍時，模型A評價進展期直腸癌新輔助放化療療效的凈收益高于模型B，因此，本研究認為模型A對于進展期直腸癌新輔助放化療療效有較高臨床應用價值，當然，還需要大樣本研究驗證該模型效能。

綜上所述，基于MRI和RTN-1C構建的模型A對進展期直腸癌新輔助放化療療效有較高的區分度、校準度和臨床應用價值，可輔助臨床做出更好決策。