缺氧地下水中石油烴類去除的原位生物修復

孫 瑞，殷 瑤，*

(1.上海市政工程設計研究總院<集團>有限公司，上海 200092；2.上海申環環境工程有限公司，上海 200092)

世界人口增長、農業生產以及工業廢物的處置不當，導致地下水環境的維持面臨巨大挑戰。石油烴(PHCs)化合物使用廣泛，已成為最常見且難降解的地下水污染物之一[1]。當前，修復被石油烴污染的地下水的傳統方法通常包含原位曝氣、土壤氣相抽提、好氧生物降解方法[2]。生物修復技術因具有操作相對簡單、低成本、二次污染小和潛在修復效果好等優點[3]，被認為是處理石油烴污染的最具前景的技術[4-5]。在生物修復過程中，微生物利用有機污染物作為能源或營養物質來源[6]。微生物修復技術主要包括通過施加營養物質進行的生物刺激和通過接種具有可分解碳氫物質能力的微生物或菌團。

目前，圍繞石油污染的修復研究主要集中在好氧條件的選取[7]。然而，許多受石油烴污染的場地由于有機污染物自然衰減耗氧而處于厭氧環境[2]。因此，采用好氧生物降解污染物時需添加大量氧氣以創造有氧環境[8]。氧氣的溶解度低，并會與缺氧地下水中的亞鐵等還原組分反應，導致注入氧氣成本昂貴且效率低下，這就需要采用厭氧微生物來處理。厭氧菌降解石油烴過程中，石油烴作為碳源，在代謝途徑中屬于電子供體，硝酸鹽、硫酸鹽或三價鐵氧化物作電子受體將有機化合物氧化為二氧化碳[9]，通過外源投加電子受體等調控方式可促進石油烴類污染物的降解[10-11]。原位厭氧生物修復技術主要被用于厭氧還原降解氯代烴污染物[12]，其厭氧氧化石油烴降解通常以實驗室研究為主[13-14]，國內實際工程應用研究較少。原位厭氧強化氧化生物修復技術(EAOB)主要針對石油烴類污染物，可以原位完全生物降解該類污染物[15]。在實際工程中，通常采用厭氧生物降解技術作為后續補救以及控制污染的重要手段。生態環境部印發的《污染地塊地下水修復和風險管控技術導則》(HJ 25.6—2019)，要求當修復達標后仍需進行兩年的監測，其時間跨度大且由于土壤和地下水修復目標值差異，可能導致地下水出現個別點位濃度復增，可采用原位厭氧生物修復再次降低污染物殘留濃度，從而保證場地修復的可持續，導則發布為該技術應用提供了新機遇。因此，探索缺氧條件下石油烴的原位微生物氧化降解具有重要意義。

論文通過開展中試試驗，在此基礎上，進行缺氧地下水原位厭氧生物修復應用研究。在探明中試區域環境特征的基礎上投加強化菌株，利用地下水中石油烴修復過程濃度變化、污染暈分析以及降解動力學表征這3方面數據評價原位厭氧生物強化作用功效，探討地下水石油烴厭氧生物修復技術的適用性和可行性，以期為原位厭氧生物修技術的推廣應用提供技術支撐。

1 試驗材料與方法

1.1 試驗材料及過程

投加的具有醌呼吸能力C8菌株源自采油井附近原油田石油污染土壤，其為以硝酸鹽氮作為電子受體的反硝化菌株，與芽孢桿菌(Bacillussp.)具有99%的相似度[16]。投加前，先將篩選的菌株接種至含硝酸鹽氮的LB培養基(蛋白胨5 g/L、氯化鈉10 g/L、酵母粉10 g/L、KNO34 g/L，調節pH值為7.0)進行富集培養。通入氬氣3 min，振蕩培養，溫度為30 ℃，轉速為150 r/min，培養10 d后再使用，從而使培養基中的易降解碳源基本消耗殆盡，此時微生物濃度達到最大化。

生物表面活性劑-鼠李糖脂購自西安瑞捷生物科技有限公司，濃度為60 g/L(純度為80%)；分析純硝酸鉀(純度≥99.0%)購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 試驗設計

1.2.1 污染場地概況

污染場地位于上海市奉賢區，歷史上主要為量具廠，其生產工藝使用機油作為清洗液，產生的廢油多被直接傾倒。量具廠生產車間位于污染場地西北側，部分歷史車間在污染范圍內。場地調查表明，西北地塊邊界外側也存在較高濃度的地下水石油烴污染。場地位置概況如圖1所示。

圖1 場地位置概況

污染地下水為淺層地下水，最大污染深度在地面下7.5 m。地下水流向大致為自西北向東南方向，平均埋深為1.5 m。場地4 m以下普遍存在一層粉砂層，滲透性較高，易造成污染的縱向遷移，最大污染深度均到達潛水含水層底板隔水層，但未穿透。場地地面下8 m范圍內地質條件為填土層(厚度為1.7～3.4 m)、粉質黏土層(厚度約為2.2 m)、粉砂土層(1.0～2.5 m)和灰色淤泥質粉質黏土層(頂板埋深為4.5～5.0 m)。

1.2.2 土壤微生物性質調查

前期調查結果表明，場地土壤和地下水中均存在石油烴污染。考慮到地下水中微生物種群較小導致測量精度差等問題，對場地范圍內不同點位和深度的土壤進行了微生物性質的調查，旨在借助調查結果，分析受污染地下水中微生物種群分布特征。為防止對建井區域造成干擾，所選擇點位S1、S2和S3分布在中試區域邊界位置，且靠近土壤石油烴污染較重處呈三角形分布(圖2)。參考場地平均地下水位(約為1.5 m)，深度從表層土至污染最深層處，在地下水位上(地下1 m)、下(地下3 m)及深層(地下5 m)進行了土壤均布采樣。

1.2.3 中試試驗

選取場地西北側地下水污染嚴重區域，設置3組地下水試驗井(井深為6 m)，開篩范圍為地表下2.0～5.5 m。其中GW1、GW2、GW3為微生物注入井，橫向間距為3 m。在GW1的北側、西側、東側1 m處均布設1口監測井，南側1 m處布置3口間隔為1 m的監測井；在GW2和GW3的南側1 m處均布設1口監測井(圖2)。試驗使用蠕動泵在注射井液面下0.5 m處注入菌液，單井單次注入2 L。另外，GW1同時投加500 mL生物表面活性劑-鼠李糖脂和2 L濃度為25 g/L KNO3的電子受體-硝酸鹽氮，GW3則只額外投加500 mL生物表面活性劑-鼠李糖脂。中試試驗開展共計63 d，具體試驗記錄如表1所示。

表1 中試過程記錄

圖2 地下水井和土壤采樣點布置平面圖

1.3 樣品采集與測試

采樣點布置如圖2所示，采樣前先用貝勒管進行洗井，貝勒管汲水位置為井管底部。每口監測井需洗出凈化3～5倍滯水體積，并測量地下水質指標(如pH、溫度、電導率)的變化。開始洗井時，控制貝勒管緩慢下降和上升，記錄洗井開始和結束時間和至少5次水質指標變化情況，待連續3次采樣水質指標穩定后，濁度在5 NTU以下則停止洗井作業。洗井過程可清除井內初次滲入的地下水中夾雜的混濁物，也可提高井內與周邊地下水之間的水力聯系。洗井過程中產生的廢水，統一收集處理。洗井作業結束，井水靜置2 h后開始取樣。對同一個監測井采樣時，貝勒管在液面0.5 m下連續不間斷采樣，確保水樣不受外界環境污染。

地下水樣品采集后立即送往實驗室于1周內完成分析，測試指標為PHCs和分段PHCs濃度，所有測試均委托具有CMA和CNAS資質的實驗室檢測。PHCs采用《水質 可萃取性石油烴(C10-C40)的測定氣相色譜法》(HJ 894—2017)相關分析方法，分段PHCs(C10-C12、C13-C16、C17-C21、C22-C40)采用《GCFID法測定 非鹵代有機物》(USEPA 8015D—2003)相關分析方法。土壤微生物性質調查的樣品，采集后委托有資質的生工生物工程(上海)股份有限公司進行生物宏基因組分類測序試驗，在測序公司提供的平臺上進行分析。

2 結果與討論

2.1 地下水PHCs污染特征

參考原《上海市污染場地風險評估技術規范》，采用《荷蘭土壤修復通告》(DutchSoilRemediationCircular2009)中地下水石油烴污染干預值(600 μg/L)作為地下水PHCs污染評價標準。基于未注入菌株前采樣結果，使用Surfer 13.0軟件進行PHCs濃度Kriging插值分析。地下水PHCs污染暈以GW2-S井為原點，呈西北向東南方向分布，與地下水流方向趨于一致(圖3)。GW2-S監測井中PHCs濃度最高達87.8 mg/L，GW1、GW2、GW3中PHCs(C22-C40)占比為68.43%～79.30%。初步判斷場地PHCs以長碳鏈為主，存在中短碳鏈PHCs。當存在PHCs時，地下水中溶解氧極易耗盡[9]。現場溶解氧測試濃度為0.24～0.41 mg/L，參考國內外原位厭氧生物修復受污染地下水基本應用條件[14,17-18](溶解氧小于2 mg/L)，可進行原位厭氧生物修復受污染的地下水。

圖3 地下水PHCs污染分布特征

2.2 可降解石油烴厭氧菌分布

采集的土壤微生物樣品經預處理(去除嵌合體及非特異性擴增序列)，通過生物序列分布對物種分類排序，可得種群級別的微生物分布。結合已報道可厭氧降解石油烴的微生物種類，篩分場地中厭氧微生物菌群，主要的10種分別為：Geobacter[19]、Thauera[20]、Dechloromonas[21]、Desulfuromonas[22]，Ralstonia[23-24]、Desulfitobacterium[19]、Desulfovibrio[25-27]、Desulfatiferula[28]、Desulfatibacillum[29]、Rhodocyclus[30]，每種菌株的代謝類型如表2所示。由此可知，場地地下存在一定量能夠進行厭氧微生物降解的微生物，但是與細菌分布整體(豐度達41 265)相比，其豐度較低，其存在可能與場地石油烴污染有一定關聯。

表2 可降解石油烴厭氧細菌分布豐度

2.3 地下水中PHCs污染變化

與厭氧微生物降解過程相比，好氧生物降解通常較緩慢[31-32]，因此，厭氧生物強化修復過程選取GW1、GW2和GW3進行分段PHCs濃度監測。試驗開始后，地下水中分段PHCs降解變化如圖4所示。2個多月(63 d)的修復過程中，地下水分段PHCs濃度占比均呈現中短鏈石油烴占比下降趨勢，甚至完全降解。這符合強化菌株C8降解石油烴特征：對于部分長碳鏈石油烴(尤其是碳鏈長度高于28)降解能力有限[16]。GW1中PHCs(C10-C12)、PHCs(C13-C16)、PHCs(C17-C21)和PHCs(C22-C40)初始占比分別為0.79%、6.51%、16.32%和76.37%，63 d厭氧修復后僅殘留PHCs(C17-C21)和PHCs(C22-C40)，分別占3.01%和96.99%。GW2中PHCs(C10-C12)、PHCs(C13-C16)、PHCs(C17-C21)和PHCs(C22-C40)初始占比分別為0.87%、4.47%、15.36%和79.30%，63 d厭氧修復后僅殘留PHCs(C17-C21)和PHCs(C22-C40)，分別占8.40%和91.60%。GW3中PHCs(C10-C12)、PHCs(C13-C16)、PHCs(C17-C21)和PHCs(C22-C40)初始占比分別為1.97%、10.12%、19.49%和68.42%，63 d厭氧修復后殘留PHCs(C13-C16)、PHCs(C17-C21)和PHCs(C22-C40)，分別占0.56%、2.56%和96.88%。需要說明的是，中試場地在14～21 d時遭受外來破壞(臨近土層被挖)，短鏈占比在此時出現了復增上升情況。

圖4 分段PHCs占比變化(a)～(c)及PHCs污染暈分布范圍對比(d)～(e)

由地下水中PHCs污染暈分布范圍對比(圖4)可知，地下水修復期間，PHCs污染暈分布明顯收縮。以地下水中PHCs濃度在25.6 mg/L(深灰)和50.6 mg/L(白色)以上的污染面積為例，25.6 mg/L的分布范圍呈明顯收縮趨勢，而50.6 mg/L的分布由約3.899 m2縮減至0.568 m2左右，厭氧微生物強化修復作用效果較為明顯。盡管PHCs污染暈的面積明顯縮小，但地下水PHCs濃度最高的位置仍停留在GW2-S附近，并未在對流、彌散作用下沿地下水流方向遷移，說明GW2-S處可能存在殘留于土壤含水層介質中的PHCs，并仍作為潛在的污染源向地下水中不斷釋放。然而，污染暈的范圍不增大反而明顯減小，這僅依靠自然狀態下土壤的吸附作用短時間難以達到，說明地下水中PHCs受到生物降解作用的影響，大部分PHCs污染物被消耗。

2.4 PHCs降解動力學表征

確定厭氧微生物強化作用在污染場地存在后，PHCs降解動力學表征可進一步評估生物修復作用對地下水中PHCs的影響程度。中試修復場地進行了3次周期性微生物注射，在第一次注藥時，同時分別按中試試驗設計加入表面活性劑-鼠李糖和硝酸鹽氮，最后一次注藥在修復后第28 d。綜合考慮添加表面活性劑-鼠李糖和硝酸鹽氮的時間以及注藥結束時間，分析GW1、GW2、GW3中分段PHCs(C<22)污染變化(圖5)。PHCs(C<22)石油烴在前14 d呈現明顯下降，之后降解效果趨于平緩。前3次注入菌劑在28 d時完成，且前14 d內總石油烴降解受外源刺激影響顯著，同時需考察菌株C8的場地應用效果。因此，選擇中試修復前14 d和28～63 d的監測數據分段進行降解動力學模擬。

圖5 PHCs(C<22)降解動力學表征及修復過程濃度變化

利用前14 d的地下水中分段PHCs(C<22)數據，依據一級反應動力學方程對該段中試期間分段PHCs(C<22)的衰減速率進行計算，GW1、GW2和GW3的分段PHCs(C<22)衰減速率分別為0.177 9、0.056 1 d-1和0.109 3 d-1。由衰減速率可知，添加生物表面活性劑-鼠李糖脂和硝酸鹽氮的GW1井降解速率最大，其次為添加表面活性劑-鼠李糖脂的GW3，只添加強化菌株C8的GW2降解速率最低。中試前14 d的效果表明，菌株C8存在時，向地下水中投加表面活性劑和電子受體(硝酸鹽氮)，可以顯著刺激和強化菌株C8的降解能力。PHCs是疏水性有機物，水中溶解度極低，濃度較高時漂浮水面，降低了其與菌株C8的接觸。微生物攝取PHCs主要依靠表面活性劑介導和界面接觸兩種模式[33]，強化菌株C8攝取PHCs為表面活性劑介導模式[16]。添加生物表面活性劑-鼠李糖脂，增加了PHCs水相溶解，有效促進了微生物對石油烴的利用。同時，菌株C8以硝酸鹽氮作為電子受體進行厭氧生化[16]，投加電子受體可以顯著加速PHCs降解[34]。因此，表面活性劑的存在和投加充足的電子受體，明顯提高了PHCs的降解速率。

依據中試修復后28 d的地下水中分段PHCs(C<22)濃度變化(表3)，采用一級反應動力學方程對該段中試期間分段PHCs(C<22)降解動力學擬合。自然對數化GW1、GW2和GW3監測井內地下水中分段PHCs(C<22)濃度，以修復時間為橫坐標繪制散點圖(圖5)。通過擬合PHCs(C<22)濃度自然對數相對于時間的趨勢線，得出GW1、GW2和GW3內強化菌株C8降解PHCs(C<22)過程符合假一級動力學。由于污染場地地下條件較為復雜，線性回歸所得R2相對較低，但能夠真實反映降解情況。如圖5所示，14 d后PHCs降解趨于平緩，推測地下水井內投加的生物表面活性劑降解消耗殆盡，投加的硝酸鹽氮也基本反應消耗完全，額外投加表面活性劑和硝酸鹽氮的促進作用已減弱甚至已消失。GW2井僅投加菌株C8，比較GW2井14 d前和GW1、GW2、GW3井28 d后分段PHCs(C<22)的降解速率，兩者近乎相同(約0.055 d-1)。因此，推測28 d后的降解主要依靠菌株C8自身降解PHCs能力。

表3 28 d起各井中分段PHCs(C<22)濃度 (單位：μg/L)

在自然衰減作用下，Guo等[35]研究表明最適溫度條件下，含水層中PHCs降解30年的平均自然衰減率估值在0.003 76 d-1，即半衰期為184.3 d。Lü等[36]研究也發現，地下水中PHCs自然衰減速率在0.001 0～0.002 5 d-1，平均速率為0.001 5 d-1，即半衰期為462.1 d。中試區域GW1、GW2、GW3中地下水PHCs修復28 d后的降解速率在0.044 1～0.059 6 d-1，半衰期為11.63～15.72 d，比自然衰減的速率常數高出一個數量級，說明厭氧微生物強化修復作用遠強于自然衰減作用。對比類似研究，Dou等[37]分離出可降解苯的蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)，在厭氧硝酸鹽還原體系下，當苯初始濃度低于150 mg/L時能夠在25 d內被完全生物降解。Singh等[38]分離出短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)具有較高的降解潛力，能夠在兩周內達到86.94%的柴油生物降解，且接種混合菌株降解效果要低于單一菌株。與自然衰減條件相比，中試采用的原位厭氧生物強化修復技術在地下水石油烴降解效率上提高了至少10倍，但綜合考慮強化菌株C8對于降解高碳鏈(C不小于28)石油烴污染物存在一定困難，需要較多時間，故保守估計中試地下水石油烴降解效率至少提高了50%以上。缺氧環境中原位厭氧生物修復石油烴污染地下水工程應用需考慮污染物源頭阻隔、生物藥劑適宜環境塑造、污染物與微生物結合概率和提供充足的反應電子受體等影響因素，且在設計和運行時，需對修復過程定期監控，將場地環境調整至厭氧生物修復最佳應用條件。

3 結論

(1)中試區域地下水受到了不同程度的PHCs污染，在GW2-S處污染濃度最高，沿地下水流向污染降低。場地地下存在一定量能夠進行厭氧微生物降解的微生物，但豐度較低。

(2)厭氧微生物強化修復過程中，地下水中分段PHCs濃度占比均呈現中短鏈石油烴占比下降趨勢，甚至完全降解，PHCs污染暈的范圍隨修復的進行明顯減小。

(3)強化菌株C8降解PHCs(C<22)過程符合假一級動力學。投加生物表面活性劑-鼠李糖脂和電子受體硝酸鹽氮后14 d內，地下水PHCs(C<22)降解速率為0.056 1～0.177 9 d-1，受外源投加因素影響大。同時，投加鼠李糖脂和硝酸鹽氮條件下PHCs(C<22)降解速率最高，其次是只投加鼠李糖脂，均明顯高于單一添加強化菌株C8。表面活性劑誘導下，同時提供充足電子受體，有利于刺激和強化菌株C8的厭氧降解作用。

(4)菌株C8降解PHCs(C<22)28 d后主要依靠菌株自身降解PHCs能力，降解速率為0.044 1～0.059 6 d-1，半衰期為11.63～15.72 d，地下水修復區域厭氧微生物強化修復作用遠強于自然衰減作用，降解效率至少提高50%以上。