草魚TP53INP1基因的克隆及微囊藻毒素對其表達的影響

劉 林 周 穎 阮記明 梁惜梅 林長高 何 麗 隗黎麗

(江西農業大學動物科學技術學院, 南昌 330045)

腫瘤蛋白p53誘導核蛋白1(Tumor protein 53-induced nuclear protein 1,TP53INP1)是p53的靶基因, 與腫瘤發生和進展有密切關系[1]。TP53INP1在1990年末先后被3個不同的實驗室獨立鑒定并報道,最早是在小鼠胸腺中發現, 當時命名為胸腺表達酸性蛋白(Thymus-expressed acidic protein,TEAP)[2],隨后Tomasini等[3]在患胰腺炎的小鼠(Mus musculus)中發現該蛋白, 并將其命名為應激誘導蛋白(Stress-induced protein,SIP), 同年, Okamura等[4]發現p53在細胞損傷反應中可誘導一種蛋白大量表達,并將其命名為p53依賴損傷誘導核蛋白1(p53-dependent damage-inducible nuclear protein 1,p53DINP1)。2002年, 人類基因組基因命名委員會提出將TEAP、SIP和p53DINP1統一命名為TP53INP1。

盡管魚類TP53INP1基因序列在NCBI數據庫中已有登錄, 但沒有相關的文章對其分子結構、組織分布及多克隆抗體等進行研究, 尤其是缺少環境污染物對其表達影響的相關研究。微囊藻毒素(Microcystins, MCs)是淡水富營養化過程中最常見的藍藻毒素, 在中國、美國及其他許多國家的水體中都檢測到不同水平的MCs污染[5—7]。MCs結構的變體多達100余種, 其中微囊藻毒素-LR (Microcystin-LR, MC-LR)是目前研究最多、毒性最強、危害最嚴重的一種MCs[8]。目前, 已有大量研究表明, MCs可能是潛在的致癌物[9], 越來越多的流行病學研究也表明, 飲用水中MC-LR的污染與人類肝癌的發生密切相關[10]。根據報道可知MCs促進腫瘤的機制與抑制蛋白磷酸酶(PP1和PP2A)有關[11], 而原癌基因的過表達和抑癌基因的抑制可能與腫瘤發生發展也有關[9], TP53INP1作為一個與腫瘤的發生發展有密切關系的蛋白, 研究MC-LR對TP53INP1蛋白表達的影響將有助于進一步提高對MC-LR毒性及其潛在的致癌性的認識[12]。

本研究在前期對草魚(Ctenopharygodon idella)轉錄組測序的基礎上[13], 采用cDNA末端快速克隆技術(RACE), 對草魚TP53INP1基因進行克隆, 構建pET32a-TP53INP1原核表達載體, 表達TP53INP1融合蛋白, 同時, 制備了草魚TP53INP1蛋白多克隆抗體, 并采用Western blot研究了草魚TP53INP1蛋白在MC-LR脅迫下的表達變化, 以期為進一步研究TP53INP1蛋白在MC-LR致魚類毒性機制中的作用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑

間氨基苯甲酸乙酯甲烷磺酸鹽(MS-222)購于Sigma公司, RNA提取試劑盒為Invitrogen公司產品,用于RACE擴增的cDNA反轉錄試劑盒Super SMARTTMPCR cDNA Synthesis Kit及進行RACE擴增的SMARTTMcDNA Amplication Kit試劑盒購于Clontech公司, 逆轉錄試劑盒RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit及熒光定量PCR的SYBR Green Real-time PCR Master Mix購于Promeaga公司, 限制性內切酶EcoR Ⅰ和XhoⅠ購自NEB公司, 凝膠純化回收試劑盒、Taq酶、T4 DNA連接酶、Maker等購自TaKaRa公司, Bradford蛋白定量試劑盒、SDSPAGE所需試劑及組織蛋白抽提試劑盒等購自北京索萊寶, PVDF膜(0.22 μm)為Millipore公司產品;HRP標記山羊抗兔IgG購自生工生物工程有限公司,GAPDH(兔抗)購于武漢賽維爾生物科技有限公司,其他試劑如氯仿、無水乙醇和異丙醇等為中國國藥分析純產品。

1.2 方法

草魚TP53INP1基因cDNA全長的克隆根據轉錄組測序數據獲得的草魚TP53INP1基因序列,利用Primer Premier 5.0設計中間片段擴增引物(TP53INP1-MF: 5′-ATGTTCCAGAGGTTCACC-3′,TP53INP1-MR: 5′-TCAGTAGTTGTACTGCCT-3′)。分離健康草魚肝臟, 采用Super SMARTTMPCR cDNA Synthesis Kit反轉錄試劑盒合成cDNA模板,隨后用該模板進行PCR擴增, 進行膠回收和測序,比對分析獲得草魚TP53INP1中間序列。再根據這一序列設計5′RACE擴增引物(RC5-1: 5′-GGCC TTCGCTAGATAA-3′, RC5-2: 5′-GCCTTGCACC TAGATA-3′, RC5-3: 5′-ATCCACTCATCGTCC TCC-3′)和3′RACE擴增引物(RC3-1: 5′-GAGCAG ACCAAGAACGTCCGCC-3′, RC3-2: 5′-CTGTC TCGCAACGCCCTTCGCC-3′), 按照SMARTTMcDNA Amplication Kit說明書推薦的反應體系及反應條件進行5′ RACE和3′RACE擴增, 分別獲得5′和3′末端序列, 再與中間序列拼接得到全長cDNA序列。

草魚TP53INP1基因序列分析及系統發育樹的構建生物信息學在線工具分析草魚TP53INP1基因。在NCBI(ORF finder, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)上查找開放閱讀框, 蛋白質理化性質在http://us.expasy.org/tools/protparam.Html上進行分析, 信號肽預測和跨膜結構分別在http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.1和http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/上進行分析, 結構域在http://www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence-search上進行分析, PEST序列在http://emboss.bioinformatics.nl/cgi-bin/emboss/epestfind上進行分析。系統發育樹則采用Mega7.0軟件的NJ法進行構建, 在建樹之前氨基酸序列的比對用ClustalW1.81軟件。

草魚TP53INP1基因的組織表達特征分析分別取5尾健康草魚[體重: (650±131.53) g; 體長: (38.24±2.53) cm; 約24月齡], 通過尾靜脈采血, 分離肝臟、脾臟、腸道、體腎、頭腎、心臟、皮膚、肌肉、鰓和腦提取RNA, 采用RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit進行反轉錄。根據獲得的草魚TP53INP1基因設計熒光定量引物(F: 5′-TCAAC GAGAAGGAGGAGGACGA-3′, R: 5′-CAGAGAG GAGCAGGAGGAGCAG-3′), 使用quantitative Realtime PCR (qRT-PCR)方法檢測草魚TP53INP1在不同組織中的表達水平。qRT-PCR采用CFX96 Touch?Real-Time PCR Detection System, 15 μL反應體系包括: 7.5 μL SYBR Green Real-time PCR Master Mix,2.0 μL cDNA模板(10倍稀釋), 上下游引物各0.3 μL(10 μmol/L)和4.9 μL ddH2O。反應程序為: 95℃變性3min; 95℃ 10s, 58℃ 15s, 72℃ 20s, 40個循環后,72℃延伸5min。以草魚β-actin(F: 5′-CACTGTGC CCATCTACGA-3′, R: 5′-CCATCTCCTGCTC GAAGTC-3′)作為內參基因進行校正, 采用2?ΔΔCt法計算TP53INP1基因的相對表達量。

草魚TP53INP1原核表達載體構建及多克隆抗體制備選擇重組表達蛋白表達載體pET-32a,對載體和TP53INP1的序列的限制性酶切位點進行分析, 選擇EcoR Ⅰ和XhoⅠ作為載體構建的連接位點, 在TP53INP1的141—242aa這段序列內設計添加EcoR Ⅰ和XhoⅠ限制性酶切位點(下劃線標出)的引物 (F: 5′-CGGAATTCAGCCCTCGTCAACGAC CA-3′, R: 5′-CCGCTCGAGGTAGTTGTACTGCC TCTG-3′)。目的片段與pMD18-T連接, 轉化大腸桿菌DH5α, 隨機挑選菌落送生工生物工程(上海)股份有限公司測序驗證。提取測序正確的pMD18-TTP53INP1和pET-32a載體質粒, 分別用EcoR Ⅰ和XhoⅠ雙酶切, 瓊脂糖凝膠電泳檢測, 酶切產物經純化后, 將TP53INP1連接至pET-32a載體, 將連接產物pET-32a-TP53INP1轉化至BL21中, 挑選陽性菌落再次測序驗證, 獲得pET-32a-TP53INP1原核表達載體。將測序正確的菌液繼續培養, 加入0.8 mmol/L異丙基硫代半乳糖苷(Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranosidem, IPTG)在37℃誘導4h, 將誘導完的菌液用超聲波破碎, 分離上清與沉淀, 進行SDS-PAGE分析, 然后將從上清獲得的蛋白進行純化。隨后通過皮下注射純化的重組蛋白免疫新西蘭兔子, 共免疫4次(分別于第1、第12、第26和第40天注射), 兔子于第一次免疫76d后采血獲得抗血清, 抗血清用pET-32a-TP53INP1作為抗原親和純化, 隨后將獲得的抗體按1∶1000稀釋進行抗體特異性檢測分析, 剩余的抗體置于–80℃保存備用。

微囊藻毒素對草魚TP53INP1蛋白的影響購買的健康草魚[體重: (22.13±2.17) g; 體長: (12.09±1.33) cm, 約5月齡] 在實驗室暫養2周后分組注射MC-LR, 劑量分別為25、75和100 μg MC-LR/kg BW, 對照組每尾草魚經腹腔注射等量的0.80%的生理鹽水。在注射MC-LR 96h后, 分別從實驗組和對照組中各取3尾魚分離肝臟提取蛋白。蛋白樣品經12% SDS-PAGE電泳后, 采用電轉移系統轉移至PVDF膜(Millipore)上, 于5%的脫脂牛奶中封閉2h。加入1∶1000稀釋的一抗[上述制備的TP53INP1抗體或內參兔多抗GAPDH(武漢博士德生物工程有限公司)], 4℃孵育過夜。次日將膜取出后, 用TBST(武漢塞維爾生物科技有限公司)洗滌3次(每次10min), 然后在1∶3000倍稀釋的HRP標記山羊抗兔的二抗 (武漢塞維爾生物科技有限公司) 中孵育, 再次用TBST洗滌3次(每次10min), 采用ELC(武漢塞維爾生物科技有限公司)化學發光法檢測并拍照。采用AlphaEase FC軟件對蛋白條帶進行定量分析。

1.3 數據分析

實驗數據均以平均值±標準差表示, 并采用One-way ANOVA (SPSS 16.0)進行分析, 統計學顯著性水平設定P<0.05表示差異顯著。

2 結果

2.1 草魚TP53INP1基因全長cDNA序列特征分析

克隆獲得草魚TP53INP1基因全長1154 bp, 包括5′非編碼區和3′非編碼區, 分別為179和216 bp, 開放閱讀框(Open reading frame, ORF)為759 bp, 其在GenBank上的登錄號為MG797689。對其編碼氨基酸序列預測分析, 發現草魚TP53INP1編碼252個氨基酸, 屬于β類型, 分子量為27.72 kD, 理論等電點為5.13。采用signalP4.1和InterPro在線分析表明草魚TP53INP1蛋白質沒有信號肽和跨膜結構。使用Epestfind在線軟件預測分析發現草魚TP53INP1蛋白存在4個PEST結構(Poor), 得分低于閾值(5.0), 分別位于14—39、53—79、101—125和125—142aa處。

2.2 草魚TP53INP1氨基酸同源性與系統進化分析

草魚TP53INP1氨基酸序列與鯉形目鯉科的鱇浪白魚(Anabarilius grahami)相似性和一致性分別達到了99%和98%, 與斑馬魚(Danio rerio)的相似性和一致性分別達到了93%和96%, 與人(Homo sapiens)和小鼠TP53INP1 α型的相似性分別達到了63%和58%、與β型的相似性分別為59%和55%。

構建的系統進化樹結果(圖1)顯示, 草魚TP53INP1與魚類的TP53INP1的β類型聚為一大支, 哺乳動物TP53INP1的α和β類型聚為一支。其中, 草魚TP53INP1蛋白與鱇浪白魚的TP53INP1親緣關系最近。

圖1 TP53INP1的系統進化樹Fig. 1 Phylogenetic analysis of TP53INP1

2.3 草魚TP53INP1基因組織分布特征分析

qRT-PCR分析發現TP53INP1基因在所有檢測的組織中均有表達(圖2), 在肝臟中的表達量最為豐富, 其次為血液和腸道等, 在頭腎中表達量相對較低。TP53INP1基因在肝臟中的表達量相對于頭腎表達量的倍數為27.83, 顯著高于在頭腎中的表達量(P<0.05), 此外,TP53INP1基因在血液(22.04倍)、腸道(20.81倍)、心臟(16.56倍)、肌肉(16.50倍)和鰓(13.64倍)中的表達量也顯著高于在頭腎中的表達量(P<0.05)。

圖2 草魚TP53INP1基因在不同組織中的表達Fig. 2 The expression of TP53INP1 gene in different tissues of grass carp

2.4 草魚TP53INP1融合蛋白的表達與純化

SDS-PASGE檢測分析, 發現在39 kD左右位置產生目的蛋白條帶(圖3)。再通過可溶性分析, 發現該蛋白在上清中表達, 也可以包涵體的形式存在。上清經過標簽純化后, 獲得的蛋白濃度為3 mg/mL。

圖3 草魚TP53INP1重組蛋白的表達及純化Fig. 3 Expression and purification of the recombinant TP53INP1 in grass carp

2.5 草魚TP53INP1多克隆抗體的免疫鑒定

采血收集血清, 獲得草魚TP53INP1的多克隆抗體，進行Western blot分析, 得到1條約39 kD的條帶與預期蛋白大小一致, 表明本研究獲得的草魚TP53INP1多克隆抗體具有一定的特異性(圖4)。

圖4 Western blot檢測草魚TP53INP1多克隆抗體的特異性Fig. 4 The specificity of anti-TP53INP1 polyclonal antibody by western blot

2.6 微囊藻毒素-LR對草魚肝臟TP53INP1蛋白表達的影響

Western blot檢測發現草魚TP53INP1蛋白在100 μg MC-LR/kg BW劑量組中顯著抑制, 其他劑量組也有不同程度的抑制(圖5A)。以AlphaEase FC軟件對蛋白條帶進行分析發現, 對照組、25 μg MC-LR/kg BW劑量組、75 μg MC-LR/kg BW劑量組和100 μg MC-LR/kg BW劑量組中TP53INP1蛋白相對于內參蛋白GAPDH的表達量分別為0.59倍、0.57倍、0.44倍和0.07倍, 其中, TP53INP1蛋白在100 μg MC-LR/kg BW劑量組中的表達相對于對照組中的表達差異顯著(P<0.05; 圖5B)。

圖5 微囊藻毒素-LR對草魚肝臟TP53INP1蛋白表達的影響Fig. 5 The effect of MC-LR on the expression of liver TP53INP1 protein from grass carp

3 討論

TP53INP1由Okamura等[2]在小鼠的胸腺中首次發現并報道后, 其他學者進一步研究發現,TP53INP1基因被選擇性剪切后, 有2種轉錄本, 可編碼2種不同蛋白異構體, 分別為TP53INP1α和TP53INP1β(分子量分別為18和27 kD)[3]。根據結構和分子量分析可知, 本研究獲得的TP53INP1基因屬于β類型。但有研究表明, α和β類型TP53INP1在功能上差別不大[14]。TP53INP1氨基末端部分包含一個異常的PEST序列, 具有短壽命的蛋白質的特征[3,4]。PEST序列是指富含脯氨酸(P)、谷氨酸(E)、絲氨酸(S)和蘇氨酸(T)殘基。根據PEST序列假說, 含有該序列的蛋白質在細胞內可能通過由蛋白體或鈣蛋白酶介導的途徑進行降解, 因此胞內半衰期較短[15]。采用Epestfind在線軟件預測時, 有效的PEST結構依據分值高低可分為PEST motif(Symbols)、Potential(+++++)和Poor(00000)三類, 草魚TP53INP1的PEST序列的預測結果顯示其存在4個Poor PEST, 即不存在明顯的PEST結構, 這與哺乳動物的TP53INP1的特征不太一致[3,4]。但與Ex-PASy在線序列分析工具(http://www.expasy. ch/tools/protparam.html) 分析的結果比較吻合, 其預測結果顯示TP53INP1在哺乳動物中的半衰期為30h, 在酵母和大腸桿菌中的半衰期分布大于20h和10h, 不穩定指數為66.33, 這說明TP53INP1在草魚中具有穩定的胞內結構。

分析TP53INP1在不同組織中的分布特征發現,該基因在草魚中廣泛表達, 在肝臟、血液、腸道、心臟、肌肉和鰓等組織中表達比較豐富, 而在頭腎等其他組織中表達較低。這與TP53INP1在哺乳動物中的組織表達分布不太一致, Tomasini等[3]研究發現TP53INP1基因在健康大鼠胸腺、心臟和睪丸表達豐富, 而在胰腺和胃中表達低, 這可能與不同的物種有關。

TP53INP1蛋白在腫瘤中的作用與腫瘤類型相關, 其既能促進腫瘤的發生發展, 也能抑制腫瘤細胞的增殖[1]。但更多的研究證明TP53INP1是一個抑癌蛋白, 可抑制腫瘤的發展, 如有研究發現TP53INP1蛋白表達缺失可引起其他促腫瘤過程,如肝臟細胞中誘導上皮細胞間質轉型和腫瘤干細胞[16], 因此, TP53INP1蛋白的表達在腫瘤細胞中可能發揮腫瘤抑制功能。TP53INP1蛋白在大多數腫瘤組織中表達會下調, 如在人類的食管癌[17]和胃癌[18]等中表達降低。最近有研究表明, TP53INP1蛋白在人類的肝癌組織中表達也明顯下降, 并建議將TP53INP1蛋白作為診斷肝癌的一個指標[1]。在我們先前對斑馬魚的研究發現, TP53INP1蛋白在MCLR染毒6h后, 其在肝臟中表達明顯上調, 隨著時間的延長, 其表達逐漸下降[19]。本研究通過實驗室制備的TP53INP1蛋白多克隆抗體, 采用Western blot檢測分析經MC-LR誘導96h后的草魚肝臟蛋白, 發現TP53INP1蛋白在25和75 μg MC-LR/kg BW劑量組表達變化不明顯, 但在100 μg MC-LR/kg BW劑量組中的草魚肝臟TP53INP1蛋白明顯下調, 這與轉錄組測序的結果也是一致的(未發表數據), 但TP53INP1蛋白是否與MC-LR促進了肝癌的發生從而導致其表達下降還需要進一步的實驗進行驗證。研究抑癌基因表達的變化, 有助于提高對MCLR毒性及其潛在的致癌性的認識[12], 因此, 今后對TP53INP1蛋白與MC-LR誘導腫瘤產生的關系及調控機制還需進一步研究。