保護地番茄根結線蟲的病原鑒定及抗性材料篩選

劉丹 尚春明 楊進 張仙保 潘子旺 劉燕 鄭于莉

摘要 以根結線蟲病樣、番茄品種及組合為試材，采集包頭市根結線蟲暴發地一個根結線蟲病樣，進行形態學和分子生物學鑒定;利用PCR技術對24個番茄品種及組合進行Mi-1基因擴增篩選。結果表明，感染內蒙古包頭市番茄的根結線蟲為南方根結線蟲;篩選出3個純合抗根結線蟲番茄組合。抗感品種及組合均產生750 bp的特異片段，純合抗病基因的番茄組合存在TaqⅠ酶切位點，酶切后產生了570和160 bp特異性片段，為防治當地番茄根結線蟲及培育抗病品種積累材料。

關鍵詞 番茄;根結線蟲;分子生物學

中圖分類號 S-433.1? 文獻標識碼 A? 文章編號 0517-6611（2021）12-0148-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.12.037

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Pathogen Identification and Resistant Material Screening of Tomato Root knot Nematode in Protected Field

LIU Dan1， SHANG Chun ming1， YANG? Jin2 et al

（1.Baotou Institute of Agricultural Science， Baotou， Inner Mongolia 014013; 2. Inner Mongolia Agricultural University， Baotou， Inner Mongolia? 014013）

Abstract Taking the root knot nematode samples and tomato varieties and combinations as test materials， a root knot nematode disease sample from the root knot nematode outbreak area in Baotou City was collected for morphological and molecular biological identification. The Mi 1 gene amplification and screening of 24 tomato varieties and combinations were carried out by PCR technology. The results showed that the root knot nematode infected tomato in Baotou City of Inner Mongolia was the southern root knot line， three homozygous tomato combinations with resistance to root knot nematode were screened out. The resistant varieties and combinations all produced 750 bp specific fragments. The Taq I restriction site existed in the homozygous resistant tomato combinations， and 570 and 160 bp specific fragments were produced after enzyme digestion， which were used to accumulate materials for the control of local tomato root knot nematode and the cultivation of disease resistant varieties

Key words Tomato;Root knot nematode;Molecular biology

根結線蟲是一類在農作物上危害極大的植物寄生性線蟲。據不完全統計，世界各地農作物因根結線蟲危害，平均每年可使農業減產24.5%，造成經濟損失在1 000億美元以上[1]。目前，報道近百種根結線蟲有效種，能夠寄生的植物達3 000多種，其中最常見造成危害最嚴重的線蟲有南方根結線蟲、北方根結線蟲、爪哇根結線蟲、花生根結線蟲[2]。

近年來，隨著種植結構的調整，保護地蔬菜復種指數越來越高，致使根結線蟲病危害日趨嚴重，造成蔬菜大幅減產[3]。保護地番茄栽培面積相對較大，抗根結線蟲病的番茄品種相對缺乏，已成為生產上急需解決的問題[4]。內蒙古自治區隨著蔬菜供應量不斷增加，根結線蟲也迅速發展和蔓延[5]。根結線蟲已成為一類嚴重危害番茄且具有廣泛寄主的植物寄生線蟲。利用抗線蟲品種，是最為經濟、有效、安全的根結線蟲防控途徑。目前已知的番茄抗根結線蟲病的主要基因是Mi基因家族，該家族包含9個抗性基因，分別為 Mi-1、Mi-2、Mi-3、Mi-4、Mi-5、Mi-6、Mi-7、Mi-8、Mi-9，其中 Mi-1、Mi-3、Mi-7、Mi-8 表現為不耐高溫;Mi-2、Mi-4、Mi-5、Mi-6、Mi-9 表現為耐高溫[6]。目前Mi-1 基因是唯一一個被商業化利用的基因，可抗3種線蟲，在栽培番茄中具有很高的應用價值[7]。 根結線蟲的防治主要有物理防治、化學防治、生物防治以及種植抗性品種等策略[8-9]。抗性基因為番茄抗根結線蟲的育種提供了豐富的遺傳資源，篩選抗根結線蟲病的番茄品種顯得尤為重要。近十幾年來，分子生物學技術的發展，為根結線蟲的準確鑒定及抗病材料的篩選提供了重要手段。戴均濤等[10]利用 SCAR快速鑒定檢測番茄Mi基因的有無。吳媛媛等[11]利用與番茄根結線蟲病抗病基因 Mi 緊密聯鎖的 CAPS 標記進行抗病材料的檢測，證明所篩選的材料屬于單基因控制的質量性狀遺傳位點。王孝宣等[12]利用Mutiplex-CAPS技術同時檢測番茄抗根結線蟲基因（Mi）和抗葉霉病基因（Cf5）。韓娜等[13]采用酶切擴增多態性序列方法對國內市場上的26個番茄品種進行Mi檢測，篩選出含有純合Mi基因的品種。防治番茄根結線蟲危害的理想途徑是培育和利用抗蟲番茄品種。通過PCR技術，能夠快速檢測番茄材料是否含有Mi基因，有助于篩選抗蟲材料，加快抗蟲番茄育種。

筆者采集內蒙古包頭市根結線蟲主要暴發地的番茄根結線蟲病樣，通過形態鑒別法結合分子生物學技術進行根結線蟲種類鑒定及抗病品種及組合的篩選，旨在明確該地區番茄根結線蟲的種類并篩選抗病品種及組合，為當地番茄根結線蟲病的有效防治提供理論依據及培育番茄抗根結線蟲新品種積累材料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

受根結線蟲感染的番茄根部組織，采自內蒙古包頭市農大職業技術學校大棚，在發病地塊，隨機取20株番茄根系，所采樣品統一保存于4 ℃冰箱，供試的大部分番茄品種及組合為包頭市農牧業科學研究院自行選育。

1.2 試驗方法

1.2.1 形態學鑒定 。

將發病的番茄根系清洗干凈，分離被侵染的番茄根組織中的雌蟲，分離出單頭雌蟲，制作會陰花紋并觀察，參照張靠穩等[14]、馮志新[15]的方法稍作修改。挑取雌成蟲放入滴有一滴1%肥皂水的載玻片上，用解剖刀從蟲體后部約1/3處輕輕切下，再將其后部雜物用針尖輕輕清除干凈，使其切口向下，將后部展開，做成臨時裝片，在顯微鏡下觀察其會陰花紋，進行形態學鑒定。

1.2.2 病原線蟲基因組提取。

病原線蟲DNA提取，參照思彬彬等[16]的方法并稍作修改，取6 μL DNA樣品于1.0%瓊脂糖凝膠中電泳分離，以檢測DNA的濃度。

1.2.3 特異性引物。

通用引物M18s/M28s參照馮光泉等[17]設計，南方根結線蟲、北方根結線蟲、花生根結線蟲、爪哇根結線蟲特異性引物參照張鋒等[18]設計。番茄Mi-1基因引物設計參照李君明等[19]設計（表1）。

1.2.4 PCR擴增及酶切體系。

（1）引物M18s/M28s對供試線蟲ITS的PCR擴增。引物M18s/M28s的PCR擴增條件：94 ℃預變性3 min，94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，40個循環，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。取PCR產物5 μL于1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，觀察結果并拍照。

（2）引物MI-F/MI-R對南方根結線蟲的特異性PCR擴

增。擴增條件：94 ℃預變性3 min，94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，40個循環，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。取PCR產物5 μL于1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，觀察結果并拍照。

（3）番茄抗病材料Mi-1基因的PCR擴增體系及酶切體系。PCR反應體系50 μL，包括 24 μL 10×PCR bufferr（0.1 U/μL Taq DNA Polymerase，3 mmol/L MgCl2，0.4 mmol/L dNTPs），上下游引物各1 μL，1 μL DNA模板，最后加無菌雙蒸水至50 μL。擴增條件參照李君明等[19]的方法。

酶切體系為PCR擴增產物10.0 μL加入 10 U 的 Taq I 酶0.5 μL，Buffer 1.5 μL，終體積加超純水至 25.0 μL，65 ℃ 保溫1 h。PCR產物及酶切產物于2.0% 瓊脂糖凝膠在電壓80～100 V 條件下電泳45 min，以100 bp DNA Marker 為標準分子量，用凝膠成像儀觀察。

2 結果與分析

2.1 會陰花紋形態學觀察

從番茄根部挑取根結線蟲，再隨機挑取20頭雌成蟲逐一進行形態特征觀察，通過形態鑒定發現，雌成蟲會陰花紋背弓高，近方形，頂部平，平滑略呈波浪形，無明顯側線，線紋在側區處有間斷和分岔。對照文獻資料[1]，觀察到的這些特征與南方根結線蟲雌成蟲的特征一致，初步確認導致包頭市郊區保護地番茄根結線蟲病發生的病原為南方根結線蟲（圖1、2）。

2.2 引物MI-F/MI-R對南方根結線蟲的特異性PCR擴增

參照馮光泉等[17]方法提取根結線蟲DNA。利用線蟲通用引物M18s/M28s對供試線蟲ITS的PCR擴增結果表明，擴增到長度為544 bp的片段，片段之間沒有多態性，表明提取各采樣點的線蟲DNA均成功，可用于后續分析（圖3）。利用特異性引物對根結線蟲DNA進行PCR擴增，由圖4可知，南方根結線蟲特異性引物的擴增呈陽性，得到一條大小約900 bp堿基對的擴增片段;其他3個特異性引物未擴增出條帶。將PCR產物直接送測序公司測序，在基因庫中將該序列與已知南方根結線蟲序列進行BLAST同源性分析（Accesion no.MN444135.1），相似性達99.69%，由此確定包頭市郊區保護地番茄根結線蟲的病原為南方根結線蟲。

2.3 番茄抗性材料Mi-1基因檢測

由圖5A和5B可知，利用番茄抗根結線蟲特異性引物SCAR F/SCAR R對供試的424份番茄品種及組合進行Mi-1基因PCR擴增與檢測，無論抗感品種及組合均能檢測出一條750 bp特異性片段;PCR擴增產物經TaqⅠ酶切后，抗病純合基因型存在酶切位點，其中編號5、6、7的6份番茄組合均產生了570和160 bp 2條特異性片段，為純合顯性Mi-1/Mi-1抗病材料，產生了570和160 bp 2條特異性片段，其余編號的PCR產物不能被TaqⅠ酶消解，即不含顯性Mi-1基因，其基因型為純合隱性基因mi-1/mi-1（表2）。

3 結論與討論

根結線蟲病是危害國內外番茄生產的重要病害，對根結線蟲種類進行準確的鑒定和檢測成為防治該病的前提條件，隨著分子生物學的發展，運用傳統形態學分類方法并結合PCR技術，能夠快速準確地鑒定根結線蟲種類，且鑒定結果準確可靠[20]。通過采集番茄發病根部組織的根結線蟲樣本，制作根結線蟲會陰花紋，從番茄根部組織分離的線蟲經ITS擴增，南方根結線蟲特異性引物MI-F/MI-R對根結線蟲DNA進行PCR擴增、凝膠回收、測序及BLAST比對，此結果表明侵染內蒙古包頭市郊區保護地番茄的主要根結線蟲屬于南方根結線蟲。在此次鑒定中，未發現其他根結線蟲合并侵染的情況，目前發現包頭市郊區只有東河沙爾沁發生根結線蟲，導致采集的樣本不豐富，在以后的工作中需要不斷定時監測及做好防治工作。

根結線蟲已成為內蒙古赤峰市保護地主要病害，對番茄造成嚴重的產量損失，包頭市郊區番茄根結線蟲已成為逐漸發展態勢，選育抗線蟲品種是解決這一難題的根本途徑。該研究通過對24份番茄品種及組合進行Mi-1基因分子檢測，共篩選出3份純合抗病組合。3份純合抗病組合含570、160 bp 2條特異性片段，其余21份材料只含750 bp片段。這些材料中是否還含有其他Mi家族的基因還需進一步研究，同時在篩選材料的同時，發現有些材料沒有Mi-1基因，其基因型尚未可知。篩選出的純合番茄抗病組合為番茄抗根結線蟲育種親本的選擇提供抗性資源信息，將加快抗病品種的選育。

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