一種漢灘病毒和漢城病毒雙重實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法的建立

劉師文，熊 英，施 勇，李健雄，王 倩，龔 甜

漢坦病毒(hantavirus， HV)是世界范圍內(nèi)分布的對(duì)人類有嚴(yán)重不良影響的人獸共患病原體[1]，其基因組由大(L)、中(M)、小(S) 3個(gè)分段的負(fù)義單鏈RNA組成。根據(jù)基因結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，已從動(dòng)物和人類中發(fā)現(xiàn)的HV可分為50 多種基因型[2]，它們?cè)谧匀凰拗髦胁灰鸢Y狀性感染，但是在人類中經(jīng)常引起兩類急性發(fā)作傳染病，即腎綜合征出血熱(hemorrhagic fever with renal syndrome，HFRS)和漢坦病毒肺綜合征。據(jù)統(tǒng)計(jì)這兩類疾病病死率分別可達(dá)15%和50%[3]。研究發(fā)現(xiàn)，HV感染嚴(yán)重程度與病毒型別、病毒RNA載量有關(guān)[4-5]。 中國(guó)是世界上HFRS疫情最嚴(yán)重國(guó)家，年報(bào)告病例數(shù)最高達(dá)到全世界90%，全國(guó)31 個(gè)省市自治區(qū)均有病例報(bào)告[6]。在我國(guó)，最主要流行的HV 為HTNV和SEOV。早診斷、早治療對(duì)控制HFRS病死率非常關(guān)鍵。因此，建立HTNV 和SEOV雙重實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)方法對(duì)病毒進(jìn)行快速、準(zhǔn)確、分型、定量檢測(cè)，對(duì)指導(dǎo)HFRS臨床救治、降低病死率有重要意義。目前HFRS病原熒光定量Realtime-PCR檢測(cè)方法都存在一定的局限性。本研究在前期HV病毒分離、全基因組測(cè)序及構(gòu)建的HTNV和SEOV 株S基因重組質(zhì)粒菌株的基礎(chǔ)上[7-8]，以純化的重組質(zhì)粒作為定量標(biāo)準(zhǔn)品，選擇漢坦病毒的S基因?yàn)槟康幕蛟O(shè)計(jì)引物探針，建立可以快速對(duì)HTNV和SEOV進(jìn)行分型和定量檢測(cè)的雙重實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法為HFRS早期診斷、疾病防控提供技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 菌、毒株及樣品 pGEM?-T-SEOV和pGEM?-T-HTNV重組質(zhì)粒DH5a菌株菌株為本實(shí)驗(yàn)室保存，分別以AYW89-15株(HTNV)和JiangxiXinjianRn-07-2011(SEOV)全S基因構(gòu)建的重組菌株。血清樣本為2017年HFRS 監(jiān)測(cè)項(xiàng)目收集并于-80 ℃保存。

1.2 主要設(shè)備和試劑 熒光定量PCR儀(ABI7500型)，超微量蛋白核酸分析儀(BioDrop)，AgPath-ID TMOne-step RT-PCR Kit(Thermo fisher Scientific)、質(zhì)粒純化試劑盒(TAKARA)巢式RT-PCR反應(yīng)液 :PrimScriptTMOne Step rt-pcr Kit Ver.2(TAKARA)、GoTaq?Green Master Mix (Promega)。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成 從GenBank 下載HTNV 和SEOV 全S基因參考序列，分別與AYW89-15株，JiangxiXinjianRn-07-2011株基因比對(duì)選定相對(duì)保守區(qū)域、應(yīng)用CLC軟件設(shè)計(jì)Taqman熒光引物探針，由上海生物工程有限公司合成。引物探針序列見表1。

表1 HTNV和SEOV S基因引物探針序列Tab.1 Primer and probe sequences of the HTNV and SEOV S gene

1.4.1 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品制備 采用質(zhì)粒純化試劑盒提取pGEM?-T-SEOV和pGEM?-T-HTNV重組菌株的質(zhì)粒， 通過(guò)BioDrop超微量蛋白核酸分析儀測(cè)得重組質(zhì)粒濃度，然后根據(jù)阿伏伽德羅常數(shù)計(jì)算其拷貝數(shù)。

1.4.2 引物探針濃度及退火溫度的優(yōu)化 以1.0×104copies/μL陽(yáng)性質(zhì)粒為模板。體系總體積25 μL，其中RT-PCR buffer 12.5 μL；Enzyme Mix 1 μL，引物探針終濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 μmol/L，其余用ddH2O補(bǔ)足；通過(guò)比較Ct值、擴(kuò)增曲線和ΔRn值確定引物和探針終濃度。確定引物探針濃度，選擇不同的延伸溫度50 ℃、55 ℃、60 ℃進(jìn)行測(cè)試、通過(guò)比較Ct值、擴(kuò)增曲線和ΔRn值確定延伸溫度。

1.4.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線建立 將陽(yáng)性質(zhì)粒從107→10-1copies/μL的10倍系列稀釋物作為模板，設(shè)陰性對(duì)照，按照優(yōu)化后的PCR反應(yīng)體系進(jìn)行熒光RT-PCR檢測(cè)。由熒光PCR檢測(cè)軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定最低檢出限。

1.4.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 選取102、103、104copies/μL的陽(yáng)性質(zhì)粒用建立的方法進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)濃度平行做3管，計(jì)算每個(gè)濃度Ct值的批內(nèi)變異系數(shù)。每個(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)品分別進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，計(jì)算每個(gè)濃度Ct值的批間變異系數(shù)。

1.4.5 特異性實(shí)驗(yàn) 以本實(shí)驗(yàn)室保存的甲型流感病毒、登革熱病毒、新布尼亞病毒、寨卡病毒、新冠病毒陽(yáng)性核酸為模板，同時(shí)設(shè)陽(yáng)性對(duì)照(陽(yáng)性質(zhì)粒104copies/μL)和陰性對(duì)照，進(jìn)行檢測(cè)，驗(yàn)證所建立方法的特異性。

1.5 血清樣本檢測(cè) 選取10份2017年江西省HFRS急性期血清樣本(樣本編號(hào)：JXhu04-17、JXhu10-17、JXhu14-17、JXhu27-17、JXhu11-17、JXhu33-17、JXhu39-17、JXhu46-17、 JXhu47-17、JXhu51-17)，進(jìn)行核酸提取，用建立方法和巢式RT-PCR方法進(jìn)行檢測(cè)分型，分析所建立方法對(duì)臨床樣本的適用性。HV M基因巢式RT-PCR分型方法參照《腎綜合征出血熱監(jiān)測(cè)方案(試行)》，第一次RT-PCR采用HV通用外引物，引物序列為HVF: 5′-AAAGTAGGTGITAYATCYTIACAATGTGG-3′，HVR: 5′-GTACAICCTGTRCCIACCCC-3′，反應(yīng)條件： 50 ℃ 30 min; 94 ℃ 2 min;(94 ℃ 30 s、52 ℃ 45 s、72 ℃ 1 min)35循環(huán)；72 ℃，10 min。第一次RT-PCR結(jié)束后以擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，分別采用HTNV/SEOV分型引物進(jìn)行二次PCR，HTNV分型引物序列HTNVF: 5′-GAATC-GATACTGTGGGCTGCAAGTGC-3′， HTNVR: 5′-GGATTAGAACCCCAGCTCGTCT-3′,目的產(chǎn)物382 bp。SEOV分型引物序列SEOVF: 5′GTGGACTCTTCTTCTCATTATT-3′， SEOVR: 5′T-GGGCAATCTGGGGGGTTGCATG-3′，目的產(chǎn)物 417 bp。二次PCR條件：95 ℃，4 min;(94 ℃ 30 s、56 ℃ 30 s、72 ℃ 45 s)35循環(huán)；72 ℃，10 min。通過(guò)1.2%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果判斷樣品病毒基因型。

2 結(jié) 果

2.1 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品制備 經(jīng)BioDrop超微量蛋白核酸分析儀測(cè)得HTNV 和SEOV重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品濃度分別為140.4 μg/mL、120.2 μg/mL，換算成拷貝數(shù)分別為2.72×1010copies/μL，2.28×1010copies/μL。

2.2 引物探針濃度及退火溫度的優(yōu)化 根據(jù)Ct值最低、ΔRn值最高的原則確定體系引物探針終濃度均為0.5 μmol/L，延伸溫度為55 ℃。優(yōu)化后反應(yīng)體系： RT-PCR buffer 12.5 μL；Enzyme Mix 1 μL，HTNV和SEOV引物探針各0.5 μL(共3 μL)，ddH2O 3.5 μL，模板5 μL。PCR反應(yīng)條件：45 ℃ 10 min；95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，55 ℃ 45 s(采集熒光)，45個(gè)循環(huán)。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線建立 HTNV和SEOV重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增曲線見圖1，隨著核酸濃度的降低呈現(xiàn)明顯的下降的熒光信號(hào)，9個(gè)濃度(107→10-1copies/μL)標(biāo)準(zhǔn)品中，HTNV 和SEOV均有7個(gè)(107→10 copies/μL)濃度出現(xiàn)擴(kuò)增曲線。HTNV 和SEOV檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2和圖3。方程式分別為Y(Ct)=-3.985X(對(duì)數(shù)值)+41.982，(HTNV擴(kuò)增效率：95.4，相關(guān)系數(shù)R2為0.998)；Y(Ct)=-4.291X(對(duì)數(shù)值)+43.03, (SEOV擴(kuò)增效率：92.1，相關(guān)系數(shù)R2為0.999)。HTNV 和SEOV最低檢出限均為10 copies/μL。

在描述學(xué)校的校園氛圍時(shí)，使用頻率最多的為歡快的交響曲（29.51%）、文化盛宴（24.36%），認(rèn)為學(xué)校的校園氛圍很快樂(lè)和溫馨、文化氣息濃厚。而選一潭死水（21.78%）、枯藤朽木（24.36%）的學(xué)生認(rèn)為學(xué)校的校園氛圍整體不好，缺乏活力。

圖1 HTNV 和SEOV重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品(107→10-1 copies/μL)擴(kuò)增曲線Fig.1 Amplification curves of nine 1∶10 dilutions ranging from 107 copies/μL to 10-1 copies/μL of recombined plasmid

圖2 HTNV和SEOV陽(yáng)性質(zhì)粒(107→10 copies/μL)標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.2 Standard curves for HTNV and SEOV were constructed with seven 1∶10 dilutions ranging from 107 copies to 101 copies of recombined plasmid

2.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 不同濃度陽(yáng)性質(zhì)粒的Ct平均值和批內(nèi)變異系數(shù)見表2，不同濃度各做3管，每個(gè)濃度Ct值的批內(nèi)變異系數(shù)小于2%。每個(gè)濃度進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，計(jì)算每個(gè)濃度Ct值的批間變異系數(shù)，結(jié)果見表3, 批間差異小于2%。

表2 不同濃度陽(yáng)性質(zhì)粒批內(nèi)Ct平均值和變異系數(shù)Tab.2 Ct variations of three 1∶10 dilutions ranging from 102 copies to 104 copies/μL in the same assay

表3 不同濃度陽(yáng)性質(zhì)粒批間Ct平均值和變異系數(shù)Tab.3 Ct variations of three 1∶10 dilutions ranging from 102 copies to 104 copies/μL in different assays

2.5 特異性實(shí)驗(yàn) 以甲型流感病毒、登革熱病毒、新布尼亞病毒、寨卡病毒、新冠病毒陽(yáng)性核酸為模板，同時(shí)設(shè)陽(yáng)性對(duì)照(陽(yáng)性質(zhì)粒)和陰性對(duì)照進(jìn)行熒光定量RT-PCR測(cè)定方法的特異性，結(jié)果見圖3，由圖可見除SEOV和HTNV陽(yáng)性對(duì)照外,其他5種病毒均無(wú)非特異性擴(kuò)增。

圖3 HTNV和SEOV雙重實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR特異性實(shí)驗(yàn)Fig.3 Specificity of HTNV and SEOV duplexes in real-time quantitative RT-PCR

2.6 血清樣本檢測(cè) 10份血清標(biāo)本經(jīng)雙重實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)，擴(kuò)增曲線圖見圖4，其中陽(yáng)性對(duì)照出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，陰性對(duì)照未出現(xiàn)擴(kuò)增曲線， 9份為HTNV型(圖4-B)， 1份為SEOV型(圖4-C，JXhu11-17)。巢式RT-PCR電泳結(jié)果見圖5，除JXhu11-17為SEOV ，其余9份均為HTNV。2種方法檢測(cè)結(jié)果一致。

圖4 10份腎綜合征出血熱病例血清樣本雙重實(shí)時(shí)熒光RT-PCR擴(kuò)增曲線圖Fig.4 Amplification curves of 10 serum samples of HFRS patients by duplex real-time RT-PCR assay

泳道1、12為DL2000Maker，泳道2-11依次為JXhu04-17、JXhu10-17、JXhu14-17、JXhu27-17、JXhu11-17、JXhu33-17、JXhu39-17、JXhu46-17、 JXhu47-17、JXhu51-17，HTNV分型引物PCR的產(chǎn)物，泳道13-22依次為上述10個(gè)樣品SEOV分型引物PCR的產(chǎn)物圖5 10份HFRS血清樣本巢式RT-PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.5 Electrophoresis of nested RT-PCR products of 10 HFRS serum samples

3 討 論

HFRS病情復(fù)雜，臨床表現(xiàn)多樣，漏診率及誤診率高[9]。疾病早期有效的診斷方法對(duì)HFRS患者早發(fā)現(xiàn)、早治療，降低病死率，減輕疾病負(fù)擔(dān)起到非常重要的作用。目前HFRS早期診斷主要包括血清學(xué)檢測(cè)和基因檢測(cè)2個(gè)方面。血清學(xué)檢測(cè)常用的方法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)，免疫層析試紙條等，主要是檢測(cè)HV特異性IgM和IgG。血清學(xué)檢測(cè)有快速、簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)，因抗體易在病毒亞型之間產(chǎn)生交叉反應(yīng)，不能用于病毒的分型，而且血清學(xué)檢測(cè)存在窗口期。基因檢測(cè)主要采用RT-PCR[10],大多數(shù)HV RT-PCR均采用巢式PCR方法[11]，克服了普通RT-PCR靈敏度低的特點(diǎn)，但是檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，操作步驟多也增加了污染的風(fēng)險(xiǎn)[12]。熒光定量Realtime-PCR具有快速、靈敏、特異性高且污染小、可實(shí)時(shí)定量并易于標(biāo)準(zhǔn)化的特點(diǎn)已經(jīng)成為病毒分子診斷中最常用的技術(shù)[13]。

目前市場(chǎng)上HFRS漢坦病毒雙重?zé)晒釶CR試劑非常少且價(jià)格昂貴，文獻(xiàn)報(bào)道的熒光定量Realtime-PCR檢測(cè)方法都存在一定的局限性。楊鵬飛 等[14]建立了漢坦病毒通用型實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR 方法，該方法采用一對(duì)引物一條探針可實(shí)現(xiàn)對(duì)5種不同基因型別漢坦病毒進(jìn)行檢測(cè)，廣譜性好，但是該方法不能實(shí)現(xiàn)病毒的分型檢測(cè)；何芳等[15]報(bào)道新型實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法，靈敏度高、對(duì)HTNV 的最低檢出限為4.08 copies/μL，該方法僅能檢測(cè)HTNV，不適合HTNV和SEOV混合疫區(qū)使用；胡丹等[16]建立的漢坦病毒實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，能分型檢測(cè)，HTNV和SEOV最低檢測(cè)限為10 copies/μL，但是不能實(shí)現(xiàn)同一反應(yīng)管HTNV和SEOV雙重靶標(biāo)檢測(cè)，不能有效的節(jié)約試劑成本，也未見臨床樣本的應(yīng)用情況。

本研究根據(jù)HV S基因設(shè)計(jì)引物探針，建立HTNV和SEOV雙重實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法，對(duì)2種型別病毒的最低定量限均為10 copies/μL, 靈敏度高；不同濃度質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品Ct批內(nèi)和批間差異均小于2%，重復(fù)性好；與甲型流感病毒、登革熱病毒、新布尼亞病毒、寨卡病毒、新冠病毒均無(wú)交叉反應(yīng)，特異性強(qiáng)；對(duì)10份血清樣本進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果與巢式RT-PCR一致，說(shuō)明建立的方法適用于臨床腎綜合征出血熱HTNV和SEOV的檢測(cè)。本方法的試劑成本僅為商品化的雙重?zé)晒釸T-PCR試劑盒的1/5左右，檢測(cè)成本低廉，適用于大規(guī)模檢測(cè)。

綜上，本研究建立的雙重?zé)晒舛縍T-PCR方法可以快速準(zhǔn)確地對(duì)HTNV和SEOV進(jìn)行分型和定量檢測(cè)，適用于腎綜合征出血熱臨床早期診斷。

利益沖突：無(wú)