我國牛羊主產區小腸結腸炎耶爾森菌的病原特征研究

鄭 宇，李焓笑，趙 強，王 菡，胡 盼，任洪林，李巖松，柳增善，盧士英

小腸結腸炎耶爾森菌是一種食源性腸道病原體，可引起耶爾森菌病——歐盟第三大常見的人獸共患病[1]。作為能夠在0 ℃～45 ℃生存的細菌[2]，它不僅存在于各類家養動物和野生牲畜中，還存在于各種冷藏食品中[3]。人食用了被小腸結腸炎耶爾森菌污染的生豬肉或新鮮牛奶等食物，會出現腹瀉、發燒等癥狀，并且引起局部炎癥和心血管疾病等[4]。耶爾森菌病在全球范圍內流行，根據美國疾病控制與預防中心2016年的報道，美國每年有11.7萬人受到耶爾森菌病的影響，其中有640例需要住院治療，35人死亡[5]；在20世紀80年代，我國發生過2次耶爾森菌病的暴發流行[6]。由此可見，對各地區各物種的小腸結腸炎耶爾森菌流行規律和病原特征的研究是非常有必要的。為此，本研究于2018-2020年從我國牛羊主產區的牛羊養殖屠宰加工場采集各類樣本(糞、乳、飼草以及環境樣本)，采用冷增菌法處理樣本后進行菌株分離培養鑒定、毒力基因鑒定、血清型鑒定以及耐藥性鑒定，對結果進行分析，總結了近兩年全國牛羊主產區該菌的流行規律和病原學特征，為預防和監測小腸結腸炎耶爾森菌的傳播奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 參考菌株 小腸結腸炎耶爾森菌參考菌株CMCC52225購買自中國醫學微生物菌種保藏中心；HZ菌株為華中農業大學贈予菌株。

1.2 樣本采集 采集2018-2020年黑龍江省、吉林省、遼寧省、內蒙古自治區、陜西省和新疆自治區牛羊養殖屠宰加工廠的各類樣本共2 291份，其中黑龍江省744份，吉林省937份，遼寧省426份，內蒙古自治區100份，新疆自治區58份，陜西省26份。在各類樣本中，包含糞樣1 968份，乳樣152份，肉樣116份，環境樣本33份，飼草樣本22份。

1.3 儀器與試劑 小腸結腸炎耶爾森菌選擇性培養基CIN-1與增菌液改良磷酸鹽緩沖液，購買自青島海博生物技術有限公司；PCR儀與凝膠成相分析系統，購買自新加坡應用生物公司；2x M5 HiPer plus Taq HiFi PCR mix，購買自北京聚合美生物科技有限公司；立式雙層恒溫振蕩培養箱，購買自哈爾濱市東聯電子技術開發有限公司；引物由上海生工生物工程有限公司合成；血清分型所用的血清試劑為實驗室保存試劑；耐藥性鑒定所用的抗菌藥物藥敏紙片，購買自杭州微生物試劑有限公司。

1.4 樣本分離鑒定 取適量樣本置于10倍體積的改良磷酸鹽緩沖液中，4 ℃放置7～14 d以達到增菌效果，沾取增菌液于CIN-1培養基25 ℃劃線培養18～24 h后，挑取“公牛眼”狀紅色菌落于LB液體培養基中于25 ℃搖菌8 h，以foxA[7]為目的基因，直接取菌液作為模板進行PCR鑒定，將PCR結果為陽性的菌株進行生化反應鑒定，將確定為小腸結腸炎耶爾森菌的菌株于-80 ℃保存，并利用統計學方法將分離結果進行統計與分析。

1.5 毒力基因檢測 對小腸結腸炎耶爾森菌的5個主要毒力基因(ail，ystB[8]，ystA，yadA，virF[9])分別進行PCR檢測，PCR反應總體系為20 μL，其中包括2x M5 HiPer plus Taq HiFi PCR mix 10 μL，上下游引物各0.8 μL，DNA模板2 μL，其余用ddH2O補足。PCR擴增程序包括94 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 s，61 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 min，共35個循環，72 ℃延伸4 min，產物與DL2 000 marker用2%凝膠電泳分離(120 V，20 min)，引物序列見表1。

表1 基因檢測的PCR引物序列Tab.1 Primer sequences for Yersinia enterocolitica genes detection

1.6 血清分型檢測 利用多重PCR方法[10]與玻片凝集方法進行血清型檢測。玻片凝集法是將分離的陽性菌株劃線培養，挑出菌落與已稀釋的血清試劑在載玻片上混勻后觀察是否出現凝集現象，并設置生理鹽水作為空白對照。

1.7 耐藥性檢測 本實驗主要針對15種藥物進行耐藥性的檢測(氨芐西林、頭孢唑林、丁胺卡那、慶大霉素、紅霉素、諾氟沙星、環丙沙星、多粘菌素B、磺胺異惡唑、復方新諾明、氯霉素、頭孢噻吩、呋喃唑酮、恩諾沙星、氟苯尼考)。具體操作如下：取適量菌液于LB平板涂勻后貼藥敏紙片，25 ℃培養18～24 h，通過測量抑菌圈直徑大小來判斷藥物對該菌的抑制效果。耐藥性結果判定標準見表2[11]。

表2 耐藥性結果的判定標準Tab.2 Judgment criteria for drug resistance results

2 結 果

2.1 不同地區樣本分離結果 對2 291份樣本進行PCR鑒定以及生化鑒定結果見表3，共分離到109株小腸結腸炎耶爾森菌，總檢出率為4.76%，其中遼寧檢出率為20.42%，新疆為15.51%，黑龍江為0.81%，吉林為0.75%，內蒙古和陜西地區未分離出陽性菌株。利用卡方檢驗進行差異分析，結果顯示各地區檢出率差異有統計學意義(χ2=288.153，P<0.01)，遼寧和新疆檢出率遠高于其他地區。

表3 各地區樣本中小腸結腸炎耶爾森菌的分離結果Tab.3 Results of Yersinia enterocolitica in samples from various regions

表4 各種類樣本中小腸結腸炎耶爾森菌的分離結果Tab.4 Results of Yersinia enterocolitica in various samples

2.3 毒力基因檢測結果 對109株陽性菌株進行毒力基因檢測，結果顯示(見表5)有71株菌株毒力基因攜帶情況為ail-、ystA-、ystB+、yadA-、virF-，并將其定義為I型毒力基因型(65.14%)；其余的38株毒力基因攜帶情況為ail-、ystA-、ystB-、yadA-、virF-，并將其定義為II型毒力基因型(34.86%)，而上述I、II型菌株通常被認為是非致病性菌株[12]，因此，本次采樣地區中的小腸結腸炎耶爾森菌致病概率很小，并且根據毒力基因所占百分比分析，ystB是本次采樣地區小腸結腸炎耶爾森菌的優勢毒力基因。

2.4 血清分型檢測結果 對109株陽性分離菌株進行血清分型，結果見表5。共檢測出3種血清型，包含O∶5,27血清型51株(46.79%)，O∶6,30血清型3株(2.75%)，O∶5血清型3株(2.75%)，其余52株未分型(47.71%)。其中O∶6,30血清型只出現在遼寧地區(3.45%)；O∶5血清型雖然在遼寧(2.30%)和黑龍江地區(16.67%)均有檢出，但數量較少；O∶5,27血清型出現在黑龍江(66.67%)吉林(57.14%)和遼寧地區(49.43%)，不僅覆蓋范圍廣，而且所占比例高；新疆地區9株陽性菌株均未分型。綜上可知，O∶5,27血清型被認為是本次采樣地區小腸結腸炎耶爾森菌的優勢血清型。

表5 小腸結腸炎耶爾森菌分離株的血清型與毒力基因檢測結果Tab.5 Results of serotype and virulence genetypes of Yersinia enterocolitica isolates

2.5 耐藥性檢測結果 對15種抗菌藥物的耐藥性檢測結果見表6，菌株對氨芐西林、紅霉素、磺胺異惡唑和頭孢噻吩100%耐藥，對多粘菌素B和氟苯尼考100%敏感。除此之外，菌株對呋喃唑酮和復方新諾明的耐藥率較高，均在75%以上，對氯霉素較敏感。

表6 小腸結腸炎耶爾森菌分離株的耐藥性檢測結果Tab.6 Results of durg resistence of Yersinia enterocolitica isolates

3 討 論

對2018-2020年2 291份我國牛羊主產區牛羊源小腸結腸炎耶爾森菌的調查發現，這些地區的陽性樣本總檢出率為4.76%，與李旭等[13]在牛羊中的陽性總檢出率(分別為2.78%和0.89%)相符，但與2018年六安市豬糞檢出率(25%)[14]和江西省生豬源檢出率(20.86%)[15]相差較大，這可能是因為生豬是小腸結腸炎耶爾森菌的主要宿主。利用SPSS進一步分析得知各地區檢出率的差異有統計學意義，其中遼寧檢出率最高，其次是新疆、黑龍江和吉林。從樣本種類進行分析，環境樣本檢出率高達12.12%，其次是糞樣檢出率5.34%，而環境樣本中分離到的陽性菌株均來自于屠宰使用的案板，這提示各養殖屠宰加工廠要注意屠宰加工環境，以免將細菌等微生物帶入動物性食品中，影響人類健康。

毒力基因檢測結果表明，本次分離到71株毒力基因I型菌株(只含ystB毒力基因)和38株毒力基因II型菌株(不含毒力基因)。雖然I、II型被認為是非致病性菌株，但在食源性暴發疾病樣本中已經檢測到含ystB基因的菌株[16]，這說明攜帶ystB基因的菌株或許存在一定致病力，應該引起相應的重視。李旭[13]等在牛源樣本分離菌株中的非致病性菌株檢出率達到94.44%，與本研究中非致病性菌株檢出率為100%的結果相符，也與本實驗室所建立的多重PCR方法[8]結果一致，這說明近年來存在于牛羊源樣本中非致病性小腸結腸炎耶爾森菌占絕大多數，而致病性菌株較少，但致病菌株的潛在影響力仍不可忽視。

目前，在世界上已知的60余個小腸結腸炎耶爾森菌血清型中，O∶3，O∶8，O∶9，O∶5,27，O∶13a等對人類具有致病力，而我國大多數致病菌株的血清型為O∶3和O∶9[17]。本次對109株陽性分離菌株進行常見的幾種血清型檢測，沒有發現血清型為O∶3和O∶9的菌株，有少數菌株血清型為O∶5和O∶6,30，46.79%的菌株血清型為O∶5,27，其余菌株血清型待定。該地區血清型為O∶5,27的所有菌株均未被檢測出致病基因，而Platt-Samoraj等[18]在5株分離的O∶5,27血清型菌株中檢測到3株含有ail致病基因，這說明O∶5,27血清型菌株對于國內的養殖屠宰加工場所而言相對安全，但其對人類安全的威脅仍然不容小覷。

抗菌藥物的過度使用已然成為全球細菌疾病治療面臨的重要挑戰，為了減少小腸結腸炎耶爾森菌抗生素濫用的現象，本研究針對109株陽性分離株進行15種抗菌藥物的藥敏試驗，結果顯示所有分離菌株均具有耐藥現象，并且對氨芐西林、紅霉素、磺胺異惡唑和頭孢噻吩4種藥物耐藥率達到100%，對呋喃唑酮和復方新諾明也有較強耐藥性，對多粘菌素B、氟苯尼考和氯霉素敏感，這與Baumgartner等[19]的研究結果一致，說明多粘菌素B等3種藥物可以作為臨床治療的首選藥物。除此之外，本次分離菌株的多重耐藥率(對2種及以上抗菌藥物耐藥)達到100%，其中有74.39%的菌株對5種抗菌藥物耐藥，這可能與養殖場的環境消毒和喂養牲畜時過量添加抗生素有關。因此，我國應對小腸結腸炎耶爾森菌的耐藥狀況進行監測，避免日常動物飼養與臨床治療中抗生素的濫用，最終為動物和人類的健康提供保障。

利益沖突：無