姜黃素抑制胃癌淋巴管生成相關因子的機制研究*

劉宏根，楊佩穎，李小江，賈英杰

（天津中醫藥大學第一附屬醫院腫瘤科，天津 300193）

胃癌是常見的惡性腫瘤之一，中國胃癌患者就診時多伴有淋巴轉移，淋巴轉移與胃癌預后密切相關[1]。淋巴管生成在腫瘤淋巴轉移中發揮作用，是淋巴轉移的重要前提。淋巴管生成相關因子血管內皮生長因子（VEGF）-C和VEGF-D是調控淋巴管內皮細胞增殖和促進新生淋巴管生成的最重要分子，是反映淋巴管生成的重要指標[2]。前期研究發現SMYD3（SET and MYND domain-containing protein 3）與淋巴轉移密切相關[3]。目前對于胃癌淋巴轉移患者，多采用局部聯合全身治療。然而現有治療方法對患者身體損傷很大，因此尋找新的抑制淋巴轉移藥物至關重要。姜黃素是從姜黃根莖中提取的一種酚性色物質，具有抗炎、抗氧化、調節血脂、調節機體免疫功能及保護肝腎等生理功能[4]。近些年發現姜黃素具有潛在抗腫瘤作用，目前報道在誘導細胞凋亡、改變細胞周期、抑制腫瘤細胞增殖及減少腫瘤侵襲轉移中姜黃素都發揮重要作用。近些年有學者通過體內外實驗發現姜黃素能夠發揮抗淋巴管生成的作用[5]。然而姜黃素抑制胃癌淋巴管機制尚不明確。本實驗在前期研究的基礎上探索姜黃素抑制淋巴管生成相關因子的可能分子機制。

1 實驗材料與方法

1.1 細胞培養和藥物 MGC803細胞和穩定低表達SMYD3的細胞（MGC803-sh-SMYD3）購于天津時域科技有限公司。細胞培養在RPMI 1640培養基（美國Gibco BRL公司）中，添加10%胎牛血清（美國Gibco公司）和1%青霉素鏈霉素（美國Gibco BRL公司），孵育在5%的37℃CO2培養箱中。

SMYD3抑制劑BCI-121（產品號M01404）和姜黃素（產品號BP11090）購于北京百奧萊博科技有限公司。BCI-121最佳干預濃度為120 μmol/L[6]，姜黃素濃度為 10、30 和 50 μmol/L[7]。

1.2 MTT 選對數生長期的細胞，消化計數后以3 000個/孔接種于96孔板。24 h待細胞貼壁以后，加藥物處理，24、48、72和96 h棄藥物培養基，加入200 μL普通培養基，同時每孔加入MTT溶液（5 g/L）20 μL，溫箱內培養4 h，棄培養液，加入二甲基亞砜150 μL/孔，搖床震蕩10 min，至紫色結晶充分溶解后，酶標儀檢測OD值。

1.3 實時定量聚合酶鏈式反應（qRT-PCR） 總RNA提取試劑盒、DNA第一鏈合成試劑盒均購自天津時域科技有限公司。RNA完整性采用瓊脂糖凝膠電泳檢測，其透過率與純度采用紫外分光光度計檢測。以Oligo-dT15為引物，參照20 μL反應體系合成cDNA第一鏈。引物序列由北京百奧萊博科技有限公司合成并提供。反應條件為95℃預變性10 s；95℃5 s，64℃34 s，40個循環。每對引物設3個復孔。結果用ABI PRISM 7500分析，最后計算2-ΔΔCT值引物序列如下：SMYD3（5′-TCGCAACCGCCAACAGGGGAAACGG/TCCCGAGAAGGCAGCGGTCGCAGAC-3′）；VEGF-C（5＇-GCCCCAAACCAGTAACAATCA/CAGCATCCGAGGAAAACATAAA-3＇）；VEGF-D（5＇-CTGCCTGATGTCAACTGCTTAG/AGATGATCGCTTC ACTGGTCC-3＇）；GAPDH：（5′-GAAGGTGAAGGTCG GAGTC/GAAGATGGTGATGGGATTTC-3＇）。

1.4 蛋白質免疫印跡（Western Blot） 將細胞在RIPA裂解緩沖液中均勻化30 min，在4℃下，12000r/min，離心半徑10 cm，離心15 min，將裂解液清除15 min，用10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離總蛋白提取物，電轉移至PVDF。用5%脫脂牛奶阻斷非特異性結合位點60 min后，在4℃下與抗SMYD3（ab187149；Abcam）、VEGF-C（ab135506；Abcam）和 VEGF-D（ab155288；Abcam）多克隆抗體孵育隔夜。用磷酸鹽吐溫緩沖液（PBST）洗滌膜3 min，用辣根過氧化物酶（HRP）偶聯抗兔免疫球蛋白抗體（SP-9001；中山生物技術）在室溫下檢測60 min。然后用PBST對膜進行3次洗滌10 min，用增強化學發光系統觀察免疫復合物。

1.5 統計學方法 所有數據均用SPSS 20.0進行統計學分析與處理。實驗數據用均數±標準差（±s）表示，兩組均數的比較采用兩獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 SMYD3和淋巴管生成相關因子表達 胃癌MGC803細胞株中加入120 μmol/L SMYD3抑制劑BCI-121，進一步檢測了 SMYD3、VEGF-C和VEGF-D表達，結果發現MGC803細胞株中SMYD3、VEGF-C和VEGF-D mRNA和蛋白表達明顯降低（P＜0.05）。

在穩定低表達SMYD3的細胞株（MGC803-sh-SMYD3） 檢測 SMYD3、VEGF-C 和 VEGF-D mRNA和蛋白的表達，顯示MGC803-sh-SMYD3細胞株中SMYD3、VEGF-C和VEGF-D mRNA和蛋白明顯低于 MGC803 細胞株（P＜0.01）。見圖 1。

圖1 不同SMYD3表達細胞株中淋巴管生成因子的差異Fig.1 The expression of anti-lymphangiogenesis related factors in different SMYD3 expression cell lines

2.2 姜黃素對細胞增殖及對淋巴管生成相關因子的影響 MTT檢測不同時間節點不同濃度姜黃素作用MGC803細胞株細胞增殖的差異。與未加姜黃素相比，10 μmol/L姜黃素在72 h和96 h明顯抑制細胞增殖 （P＜0.05）；30 μmol/L 姜黃素在 48、72 和96 h 明顯抑制細胞增殖（P＜0.05）；而 30 μmol/L 姜黃素在 24、48、72 和 96h 明顯抑制細胞增殖（P＜0.05）（圖2a）。50 μmol/L姜黃素對胃癌細胞抑制作用最強，因此我們選用50μmol/L姜黃素進一步實驗研究。

50 μmol/L姜黃素處理MGC803細胞96 h后，檢測VEGF-C和VEGF-D表達變化。qRT-PCR和Western Blot結果顯示與未用姜黃素處理相比，姜黃素干預MGC803細胞中VEGF-C和VEGF-DmRNA和蛋白明顯降低（P＜0.05），見圖 2b-d，差異具體統計學意義。

圖2 姜黃素對細胞增值及淋巴管生成因子的影響Fig.2 The proliferation of cells and the expression of anti-lymphangiogenesis related factors affected by curcumin

2.3 姜黃素抑制淋巴管生成相關因子可能機制探索 120 μmol/L BCI-121聯合50 μmol/L姜黃素處理MGC803細胞96 h后，檢測VEGF-C和VEGF-D表達變化，結果顯示較50 μmol/L姜黃素處理，聯合處理組MGC803細胞中VEGF-D mRNA和蛋白的表達降低（P＜0.05），而 VEGF-C 變化無統計學差異。

50 μmol/L黃素處理MGC803細胞和MGC803-sh-SMYD3細胞96 h后，檢測VEGF-C和VEGF-D表達變化，結果顯示較MGC803-sh-SMYD3細胞中VEGF-D mRNA和蛋白的表達明顯低于MGC803細胞（P＜0.05），而 VEGF-C mRNA 和蛋白變化不明顯。見圖3。

圖3 姜黃素干擾不同SMYD3表達細胞株中淋巴管生成因子的差異Fig.3 The expression of anti-lymphangiogenesis related factors in different SMYD3 expression cell lines affected by curcumin

3 討論

淋巴管生成在腫瘤淋巴轉移中發揮至關重要的作用[8]。淋巴管生成相關因子VEGF-C和VEGF-D通過結合VEGFR-3后引起下游分子Shc、Grb2磷酸化，導致MARK信號途徑促使淋巴內皮細胞增生、遷移和存活而形成新生的淋巴管道，從而為腫瘤細胞發生淋巴轉移提供有利條件。淋巴管生成相關因子VEGF-C和VEGF-D與淋巴管生成和淋巴轉移密切相關[9]。SMYD3是近年來發現的與腫瘤密切相關的一種具有組蛋白甲基化功能的蛋白，功能上通過影響下游基因起到抑制腫瘤細胞凋亡、促進細胞增殖及侵襲、擴散作用[10]。SMYD3在多種腫瘤中發揮癌基因作用。前期臨床研究中發現SMYD3與胃癌預后密切相關，進一步發現伴有淋巴轉移胃癌患者中SMYD3陽性率較高，因此推測SMYD3與淋巴轉移密切相關[11]。為證實SMYDE3與淋巴管生成相關因子VEGF-C和VEGF-D關系，在胃癌細胞株中加入SMYD3抑制劑BCI-121，結果發現干擾SMYD3表達后VEGF-C和VEGF-D表達發生降低；進一步在穩定低表達SMYD3細胞株MGC803-sh-SMYD3中檢測VEGF-C和VEGF-D表達，同樣發現MGC803-sh-SMYD3細胞中VEGF-C和VEGF-D表達低于正常細胞。結合前期研究，筆者認為胃癌中高表達的SMYD3能夠促進淋巴管生成相關因子VEGF-C和VEGF-D表達。

傳統中醫藥具有多靶位，多機制，多方向，并且不良反應少的優點。姜黃素作為姜黃重要組成部分，有著極其廣泛的藥理作用。近些年姜黃素發現在多種惡性腫瘤中有抑制腫瘤生長的作用[12]。在胃癌中，姜黃素通過抑制c-Myc/H19、PAK1/cyclin D1、11和對磷酸鳥苷醇-3激酶（PI3K）信號通路抑制胃癌細胞增殖的作用[13]。近些年許多學者發現姜黃素能夠抑制胃癌淋巴結轉移[14]，本研究同樣發現姜黃素可以降低淋巴管生成相關因子VEGF-C和VEGF-D表達進而影響淋巴管生成。但目前機制尚不清楚。為探索姜黃素抑制胃癌淋巴管生成相關因子是否與SMYD3相關，首先將SMYD3抑制劑BCI-121和姜黃素聯合干預胃癌細胞株，結果發現與單獨姜黃素干預，聯合組VEGF-D表達明顯降低。進一步通過姜黃素干擾MGC803細胞和MGC803-sh-SMYD3，發現MGC803-sh-SMYD3細胞中VEGF-D表達明顯降低，而VEGF-C表達無差異。因此推測姜黃素可能通過抑制SMYD3通路進而抑制淋巴管生成相關因子VEGF-D。

4 結論

本研究證實SMYD3與淋巴管生成相關因子VEGF-C和VEGF-D密切相關，姜黃素可能通過抑制SMYD3通路進而抑制淋巴管生成相關因子VEGF-D，進而影響胃癌淋巴管的生成。