蚯蚓糞對(duì)檳榔根圍土壤微生物多樣性的影響

馬思遠(yuǎn)，王海花，林雨彬，曾若菡，刁曉平,3，李 鵬

（1. 海南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，海口 571158; 2. 海南大學(xué) 生態(tài)與環(huán)境學(xué)院，海口 570228;3. 海南大學(xué) 南海海洋資源利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海口 570228）

檳榔（Areca catechuL.）屬棕櫚科多年生常綠喬木，是熱帶珍貴藥用植物，為四大南藥之首。海南是我國(guó)檳榔的主產(chǎn)區(qū)，全省檳榔種植面積約為102 530 hm2，產(chǎn)量約255 114 t，占全國(guó)產(chǎn)量的95%以上，主要分布于萬(wàn)寧市（18 138 hm2）、瓊海市（16 311 hm2）、瓊中縣（12 447 hm2）、屯昌縣（11 092 hm2）、定安縣（8 917 hm2）和保亭縣（6 685 hm2）[1]。目前，海南約有230萬(wàn)農(nóng)民從事檳榔種植，檳榔已經(jīng)成為海南農(nóng)民重要的經(jīng)濟(jì)來(lái)源。海南檳榔產(chǎn)業(yè)年產(chǎn)值超過(guò)百億元，已經(jīng)成為海南省重要的支柱產(chǎn)業(yè)[1]，但在檳榔種植規(guī)模迅速擴(kuò)大的同時(shí)，檳榔黃化現(xiàn)象對(duì)海南省檳榔產(chǎn)業(yè)造成了嚴(yán)重的威脅。據(jù)初步調(diào)查，海南省已有上萬(wàn)畝檳榔樹(shù)出現(xiàn)了黃化現(xiàn)象，導(dǎo)致植株掛果嚴(yán)重減少，發(fā)病嚴(yán)重的植株會(huì)逐漸枯死，且檳榔黃化呈現(xiàn)逐年加重的趨勢(shì)，給檳榔產(chǎn)業(yè)造成了巨大損失[2]。關(guān)于檳榔黃化的病因，有報(bào)道認(rèn)為導(dǎo)致檳榔黃化的原因主要包括類(lèi)細(xì)菌和類(lèi)菌原體[3]，后來(lái)在海南檳榔黃化病病株的葉脈、葉鞘基部發(fā)現(xiàn)植原體[4]，且也有報(bào)道認(rèn)為椰心葉甲、介殼蟲(chóng)、棕櫚長(zhǎng)翅蠟蟬、飛虱等害蟲(chóng)的危害也會(huì)導(dǎo)致黃化的發(fā)生；此外，栽培不當(dāng)也會(huì)導(dǎo)致檳榔黃化病的發(fā)生，如使用化肥、除草劑和其他用藥不當(dāng)?shù)萚5]。目前，治療檳榔黃化尚無(wú)非常有效的防治方法，仍采用挖出病株并燒毀，或使用廣譜性的殺菌劑等方法，但效果均不理想。

生物有機(jī)肥往往通過(guò)功能微生物的大量繁殖，改變了土壤微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)而對(duì)植物根系形成保護(hù)和促生作用[6]，且根系分泌物介導(dǎo)下的植物－微生物互作關(guān)系變化對(duì)于土壤肥力、健康狀況以及植物生長(zhǎng)發(fā)育有著極其重要的作用[7]。因此，在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，根系周?chē)奈⑸镱?lèi)群顯著影響著植物對(duì)土壤中養(yǎng)分、重金屬的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)、作物根際微生物種群的結(jié)構(gòu)等[8]；一些有害微生物也會(huì)對(duì)作物的生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用，影響其生長(zhǎng)發(fā)育[9]。蚯蚓糞是蚯蚓的代謝物，在種植業(yè)上應(yīng)用價(jià)值較大。蚯蚓糞本身具有速效、長(zhǎng)效、抗病、改良土壤和抗板結(jié)作用[10]，而且其中的功能微生物還可以不斷將土壤中作物難以吸收的養(yǎng)分轉(zhuǎn)化為易吸收的形態(tài)[11]，提高養(yǎng)分利用率，從而提高農(nóng)作物產(chǎn)量、改善產(chǎn)品品質(zhì)[12]，目前蚯蚓糞已得到了廣泛的應(yīng)用并取得了很好的效果。

由于目前對(duì)于檳榔根系微生物組的研究報(bào)道較少，且蚯蚓糞緩解檳榔黃化的機(jī)制有待進(jìn)一步解析，本研究擬通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)比較施用蚯蚓糞前后檳榔跟圍土微生物多樣性的變化，并結(jié)合分析其與土壤理化性質(zhì)的相關(guān)性分析，探究蚯蚓糞對(duì)檳榔園土壤微生物多樣性以及互作網(wǎng)絡(luò)的影響，旨在找出施加蚯蚓糞組、蚯蚓糞和化肥組與對(duì)照組的差別，揭示改善檳榔黃化現(xiàn)象的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)研究選取萬(wàn)寧龍滾檳榔種植園為實(shí)驗(yàn)區(qū)，在根系設(shè)置蚯蚓糞、蚯蚓糞和化肥、無(wú)任何添加共3種處理，10個(gè)月后進(jìn)行采樣，比較分析施加后3種處理下的土壤細(xì)菌和真菌多樣性變化、微生物多樣性和土壤理化性質(zhì)的關(guān)聯(lián)分析，并比較了3種處理下的微生物互作網(wǎng)絡(luò)。蚯蚓糞來(lái)自三亞鑫苑農(nóng)業(yè)科技發(fā)展有限公司。全氮、全磷和全鉀含量≥5%，有益活菌≥0.2億個(gè)·g-1，有機(jī)質(zhì)含量≥20%，pH7.0。

2019年1月中旬進(jìn)行蚯蚓糞以及化肥的施加，在示范地選取3塊長(zhǎng)勢(shì)一致的檳榔種植園，檳榔樹(shù)齡均為10 a，分別對(duì)每棵擯榔樹(shù)施加蚯蚓糞（10 kg）、施蚯蚓糞和化肥（10 kg）、不作任何處理的區(qū)域。在兩棵相鄰檳榔樹(shù)中間挖10 cm2×50 cm2左右的方形壕溝，分別進(jìn)行上述3種處理。施肥10個(gè)月后取樣，在3塊區(qū)域中分別劃分4塊小區(qū)域，每塊小區(qū)域選取3棵檳榔樹(shù)，取地下10 cm左右、施肥附近的土壤，每份樣品約500 g。不同處理的區(qū)域各取4份，共12份樣品。在土樣采集時(shí)均佩戴無(wú)菌手套，將采集的土壤樣品迅速置于冰盒中存放，一部分樣品用于土壤理化性質(zhì)的分析，一部分用于土壤微生物DNA的提取 ，用于提取DNA的土壤樣品帶回實(shí)驗(yàn)室后立即進(jìn)行DNA的提取。

1.2 土壤理化性質(zhì)測(cè)定將采集到的土壤自然晾干，按標(biāo)準(zhǔn)法測(cè)定樣品的基本理化性質(zhì)[13]。測(cè)量指標(biāo)為：pH值、有機(jī)質(zhì)（Organic Matter，OM)、全氮（Nitrogen，N）、堿解氮（Alkali-hydrolyzable nitrogen，HN）、全 磷（Phosphorus，P）、速效磷（Olsen-P，OP）、全鉀（Potassium，K）、速效鉀（Avail K，AK）。

1.3 土壤微生物DNA提取及測(cè)序?qū)⒉杉降耐寥肋M(jìn)行DNA的提取，采用德國(guó)QIAGEN公司的DNeasy PowerSoil Kit試劑盒，按說(shuō)明書(shū)提取。通過(guò)超微量分光光度計(jì)（NanoDrop 1000）檢測(cè)DNA濃度≥20 ng·mL-1，OD260/280為1.8～2.0。即為合格。提取的DNA保存于-40 ℃條件下用于后續(xù)PCR擴(kuò)增。

擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA基因的引物采用338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)，并采用IIIumina Miseq 2·300測(cè)序平臺(tái)對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雙端測(cè)序 。測(cè)序部分由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

1.4 微生物多樣性分析測(cè)序完成后，對(duì)有效序列進(jìn)行去雜、修剪、去除嵌合體等過(guò)濾處理，得到優(yōu)化序列。基于OTU聚類(lèi)分析結(jié)果，對(duì)OTU進(jìn)行多種多樣性指數(shù)分析，以及對(duì)測(cè)序深度的檢測(cè)；基于分類(lèi)學(xué)信 息，在各個(gè)分類(lèi)水平上進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)的統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對(duì)土壤理化性質(zhì)的影響由表1可見(jiàn)，與對(duì)照（TLG3）相比，施加蚯蚓糞、蚯蚓糞和化肥處理后土壤理化性質(zhì)表現(xiàn)出明顯差異，所測(cè)指標(biāo)都有明顯上升，均具有顯著性差異（P＜0.05）。兩個(gè)處理組相比，除施加蚯蚓糞組（TLG1）的pH和速效鉀高于蚯蚓糞加化肥處理組（TLG2）外，其他的理化因子指標(biāo)都 相反，其中全氮、全磷、全鉀、堿解氮和速效鉀達(dá)到顯著性差異。

表1 不同處理方式下檳榔種植區(qū)土壤的理化性質(zhì)Tab. 1 Soil physical and chemical properties in the rhizosphere of arecanut plants in the arecanut plantation

2.2 不同處理方式下檳榔土壤細(xì)菌的多樣性分析

2.2.1 不同處理對(duì)細(xì)菌群落多樣性的影響97%相似水平上對(duì)土壤樣品細(xì)菌群落進(jìn)行alpha多樣性指數(shù)分析，結(jié)果（表2）表明，與對(duì)照組相比，施加蚯蚓糞組和蚯蚓糞加化肥組檳榔土壤細(xì)菌的Shannon指數(shù)有明顯升高，Simple指數(shù)明顯降低，表明施加蚯蚓糞和蚯蚓糞加化肥處理后檳榔土壤細(xì)菌群落多樣性升高，且只施加蚯蚓糞的處理組中的細(xì)菌群落多樣性高于施加蚯蚓糞和化肥的處理組。

表2 細(xì)菌群落多樣性指數(shù)Tab. 2 Diversity index of bacterial community in the rhizosphere

2.2.2 不同處理對(duì)土壤細(xì)菌類(lèi)群分布的影響在屬水平上對(duì)OTU進(jìn)行聚類(lèi)分析，得到不同處理組的檳榔樹(shù)土壤的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成，結(jié)果（圖1）表明，在屬水平上只施加蚯蚓糞的處理中，主要的菌屬為熱酸菌屬（Acidothermus，9.45%）、norank_f_norank_o_Acidobacteriales（3.84%）、不動(dòng)桿菌屬（Acidibacter，3.69%）、Occallatibacter（3.04%）；在施加蚯蚓糞加化肥的處理組中，主要的屬為熱酸菌屬（Acidothermus，13.84%）、norank_f_norank_o_Acidobacteriales（3.52%）、不動(dòng)桿菌屬（Acidibacter，5.18%）、norank_f_Xanthobacteraceae（4.88%）；在對(duì)照組中主要的屬為：norank_f_norank_o_Subgroup_2（10.99%）、norank_f_norank_o_Acidobacteriales（9.48%）、獨(dú)活假絲酵母屬（Candidatus Solibacter，5.19%）。此外還包括norank_f_norank_o_Acidobacteriales、norank_f_norank_o_Subgroup_2、norank_f_Xanthobacteraceae、norank_f_norank_o_Elsterales、norank_f_norank_o_norank_c_norank_p_WPS-2、norank_f_norank_o_norank_c_AD3和Conexibacter等。

圖1 屬水平下檳榔土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成Fig. 1 Bacterial community composition at the genus level in the rhizosphere of arecanut plants

2.2.3 不同處理下的細(xì)菌類(lèi)群顯著性差異分析分別對(duì)蚯蚓糞組和蚯蚓糞加化肥組與對(duì)照組的細(xì)菌類(lèi)群在屬的水平上進(jìn)行了組間差異分析。結(jié)果（圖2）表明，在只施加蚯蚓糞與對(duì)照的比較中（圖2-a），norank_f_norank_o_Acidobacteriales、獨(dú)活假絲酵母屬（Candidatus Solibacter）、norank_f_norank_o_norank_c_AD3和Conexibacter達(dá)到了極顯著水平，norank_f_norank_o_Subgroup_2達(dá)到了顯著性水平。在施加蚯蚓糞-化肥的處理組與對(duì)照的比較中（圖2-b），熱酸菌屬（Acidothermus）、獨(dú)活假絲酵母屬（Candidatus Solibacter）和Conexibacter達(dá)到了極顯著水平，norank_f_norank_o_Subgroup_2、norank_f_norank_o_Acidobacteriales和norank_f_norank_o_norank_c_AD3達(dá)到了顯著性水平。

圖2 不同處理下細(xì)菌菌屬與對(duì)照組差異分析a. 施加蚯蚓糞后；b. 施加蚯蚓糞和化肥后。*表示具有顯著性差異；**和***表示具有極顯著性差異。Fig. 2 Analysis of difference in bacteria at the genus level between the treatments and the controla. Bacterial difference between TLG1 and TLG3 at the genus level; b. Bacterial difference between TLG2 and TLG3 at the genus level. * indicates that there are significant differences between the two treatments；** and *** indicate that there are extremely significant differences in the figure.

2.2.4 不同處理下土壤理化性質(zhì)與微生物分布的相關(guān)性分析結(jié)合理化性質(zhì)，在細(xì)菌門(mén)水平上對(duì)施加蚯蚓糞前后的土壤和對(duì)照組進(jìn)行了Redundancy Analysis（RDA）分析（圖3）。RDA分析顯示，第一主軸能夠解釋所有信息的72.21%，第二主軸能夠解釋11.30%，兩者累計(jì)解釋所有信息的83.51%。pH和速效鉀對(duì)物種影響程度最大，各環(huán)境因子之間均呈正相關(guān)。只施加蚯蚓糞組中，TLG1-1、TLG1-3、TLG1-4微生物群落變化與所有環(huán)境因子之間呈正相關(guān)，TLG1-2與全鉀、速效磷呈負(fù)相關(guān)，與其余環(huán)境因子呈正相關(guān)。蚯蚓糞加化肥組中，TLG2-1、TLG2-3、TLG2-4與所有環(huán)境因子呈正相關(guān)，TLG2-2與所有環(huán)境因子呈負(fù)相關(guān)。對(duì)照組中所有樣本微生物群落變化與所有環(huán)境因子呈負(fù)相關(guān)。變形菌門(mén)(Proteobacteria)、放線(xiàn)菌門(mén)（Actinobacteria）與所有環(huán)境因子呈正相關(guān)，WPS-2、酸桿菌門(mén)（Acidobacteria）、綠彎菌門(mén)（Chloroflexi）與所有環(huán)境因子呈負(fù)相關(guān)。其微生物群落程度表現(xiàn)為：酸桿菌門(mén)（Acidobacteria）＞綠彎菌門(mén)（Chloroflexi）＞W(wǎng)PS-2。

圖3 不同處理下微生物群落與土壤指標(biāo)RDA排序圖Fig. 3 RDA ordination diagram for microbial community and soil index of each treatment

2.2.5 不同處理下物種間的相關(guān)性為了分析物種與物種之間的相關(guān)性，在門(mén)的水平上對(duì)樣本豐度前50的種進(jìn)行單因素網(wǎng)絡(luò)分析（圖4）。對(duì)照組中分類(lèi)水平總豐度前50的物種中（圖4-c），主要的門(mén)為Acidobacteriota（17）、Firmicutes（3）、Planctomycetota（1）、Chloroflexi（9）、WPS-2（1）、GAL15（3）、Myxococcota（1）、Proteobacteria（10）、Actinobacteriota（6）、FCPU426（1）和Bacteroidota（1）；在只施加蚯蚓糞的處理組中（圖4-a），主要的門(mén)為Cyanobacteria（1）、Actinobacteriota（14）、Proteobacteria（19）、WPS-2（2）、Patescibacteria（1）、Acidobacteriota（11）和Chloroflexi（2）；在施加蚯蚓糞和化肥的處理組中（圖4-b），主要的門(mén)為Proteobacteria（20）、Actinobacteriota（11）、Acidobacteriota（11）、WPS-2（2）、Patescibacteria（1）和Chloroflexi（5）。可以看出前50豐度的物種在門(mén)水平上處理組相對(duì)于對(duì)照組少了Firmicutes、Planctomycetota、GAL15、Myxococcota、FCPU426和Bacteroidota所包含的菌種。只施加蚯蚓糞的處理組中多出了Cyanobacteria門(mén)的一種菌（s_unclassified_g_norank_f_norank_o_Chloroplast），豐度前50的物種有8種與其有相關(guān)性，其中大多數(shù)為負(fù)相關(guān)。施加蚯蚓糞-化肥的處理組中多出了Patescibacteria門(mén)的一種菌（s_uncultured_bacterium_g_norank_f_LWQ8），豐度前50的物種有8種與其有相關(guān)性，其中大多數(shù)為正相關(guān)。

圖4 不同處理下單因素網(wǎng)絡(luò)分析a. 施加蚯蚓糞組；b. 施加蚯蚓糞加化肥組；c. 對(duì)照組。圖中節(jié)點(diǎn)的大小表示物種豐度大小，不同顏色表示不同的物種；連線(xiàn)的顏色表示正負(fù)相關(guān)性，紅色表示正相關(guān)，綠色表示負(fù)相關(guān)；線(xiàn)的粗細(xì)表示相關(guān)性系數(shù)的大小，線(xiàn)越粗，表示物種之間的相關(guān)性越高；線(xiàn)越多，表示該物種與其他物種之間的聯(lián)系越密切。Fig. 4 Monofactor network analysis of different treatments a. Monofactor network analysis of TLG1; b. Monofactor network analysis of TLG2; c. Monofactor network analysis of TLG3. The size of nodes in the graph indicates the species richness, and different colors indicate different species; the color of lines indicates positive and negative correlation, red indicates positive correlation, and green indicates negative correlation; the thickness of lines indicates the size of correlation coefficient; the thicker the line, the higher the correlation between the species;the more the lines, the closer the relationship between a species and other species.

3 討 論

施加蚯蚓糞可以提高土壤pH，有效抑制土壤的酸化；且檳榔種植區(qū)的土壤有機(jī)質(zhì)、全氮、全磷、全鉀、堿解氮、速效磷和速效鉀的含量均有明顯增加。土壤有機(jī)質(zhì)是土壤養(yǎng)分的重要組成部分[14]，能夠改善土壤的物理和理化性質(zhì)[15]，同時(shí)也是各種植物生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)來(lái)源[16]。施加蚯蚓糞后土壤中有機(jī)質(zhì)含量有明顯升高，表明其土壤得到了改善。

97%相似水平上對(duì)土壤樣品細(xì)菌群落進(jìn)行alpha多樣性指數(shù)分析，結(jié)果表明，施加蚯蚓糞后其微生物多樣性升高，這與周東興等[17]的研究結(jié)果一致，周東興等人通過(guò)研究施加蚯蚓糞對(duì)溫室黑土酶活性以及細(xì)菌多樣性的影響，證明蚯蚓糞的施加提高了土壤的細(xì)菌多樣性。施加蚯蚓糞及蚯蚓糞-尿素的處理均對(duì)土壤微生物的多樣性造成了顯著的影響，如獨(dú)活假絲酵母屬（Candidatus Solibacter）和Conexibacter出現(xiàn)了顯著性差異，其中獨(dú)活假絲酵母屬（Candidatus Solibacter）已有報(bào)道表明其為分解有機(jī)質(zhì)、利用碳源的菌屬，與土壤有機(jī)質(zhì)含量呈正相關(guān)關(guān)系[18]。通過(guò)土壤理化性質(zhì)和微生物在細(xì)菌門(mén)水平上分布的RDA分析，結(jié)果表明，理化因子之間速效鉀的含量達(dá)到顯著性差異，同時(shí)N、P、K的含量都有所增高。這與王英男等[19]研究蚯蚓糞可以提高土壤營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)N、P、K含量是一致的。

通過(guò)單因素網(wǎng)絡(luò)分析施加蚯蚓糞和施加蚯蚓糞和化肥后的土壤。只施加蚯蚓糞的處理組中多出了Cyanobacteria門(mén)的一種菌（s_unclassified_g_norank_f_norank_o_Chloroplast），施加蚯蚓糞-化肥的處理組中多出了Patescibacteria門(mén)的一種菌（s_uncultured_bacterium_g_norank_f_LWQ8）。這兩種未命名的菌種對(duì)檳榔黃化也許有一定影響。

蚯蚓糞在促進(jìn)作物生長(zhǎng)、提高產(chǎn)量、改善土壤肥力和抑制植物病害等方面均有重要作用[20]。錢(qián)春桃等[21]將蚯蚓糞肥均勻撒施在松花菜地里，發(fā)現(xiàn)可以有效降低連作地土壤水溶性鹽總量（EC），緩解土壤酸化，提高土壤速效碳氮鉀的含量；張峰等人[22]發(fā)現(xiàn)蚯蚓糞肥極顯著提高土壤NaOH-Po含量和酸性磷酸酶活性，有效促進(jìn)NaOH-Po活化的同時(shí)提高微生物對(duì)磷的貯存能力，提高磷肥利用率。因此，研究表明蚯蚓糞對(duì)改善土壤肥力以及保證作物健康生長(zhǎng)具有重要的作用。本研究通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)外源施加蚯蚓糞對(duì)檳榔種植區(qū)的土壤微生物多樣性進(jìn)行了比較分析，結(jié)果表明，施加蚯蚓糞可顯著提升土壤養(yǎng)分，改善土壤狀況，增強(qiáng)微生物之間的多樣性。此結(jié)果為深入解析蚯蚓糞對(duì)檳榔黃化的緩解機(jī)制奠定基礎(chǔ)。