紅景天苷對小鼠高氧肺損傷的保護作用及對Notch信號通路的調節機制研究

朱文亮黃曉佩邱 實馮凌霄邵換璋

(河南省人民醫院重癥醫學部,鄭州 450000)

1 材料和方法

1.1 實驗動物

C57BL/6 小鼠 50 只,SPF 級,雌雄各半,6~8 周齡,體重18~22 g,由河南省實驗動物中心提供[SCXK(豫)2017-0001],實驗于河南省實驗動物中心實驗室獨立動物房[SYXK(豫)2016-0002]進行。研 究 方 案 獲 本 院 倫 理 委 員 會 批 準(HNSRMYY2019002),實驗嚴格遵循實驗動物使用的3R 原則給予人道關懷。

1.2 主要試劑與儀器

地塞米松磷酸鈉注射液(天津天藥藥業股份有限公司,批號:170123);紅景天苷(純度≥98%,南京澤朗生物科技有限公司,批號20181108);Notch1、HERP、Hes1 兔源單克隆抗體、羊抗兔二抗(美國CST 公司,批號:3608、26730、11988、7074);實驗所需耗材均購自北京索萊寶科技有限公司。 倒置顯微鏡(日本 OLYMPUS 公司);血氣分析儀(美國Instrumentation Laboratory Company);氧氣濃度分析儀(北京世聯博研科技有限公司);二氧化碳監測儀(北京中創匯安科貿有限公司);PCR 儀(美國Applied Biosystems 公司); 凝膠成像儀(美國Syngene 公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 分組與造模

將50 只C57BL/6 小鼠隨機分為5 組,每組10只。 模型組、陽性對照組、紅景天苷高、低劑量組小鼠均建立高氧肺損傷模型。 造模方法:將小鼠置于自制密閉氧氣艙內,氧艙連接輸氧管、氧氣濃度分析儀和二氧化碳監測儀,箱內放置鈉石灰用以吸收小鼠呼出的CO2,保持箱內CO2濃度低于0.5%,調節氧氣流量,使氧艙內氧濃度高于95%,模型組、陽性對照組、紅景天苷高劑量組和低劑量組小鼠均持續暴露于氧氣艙內3 d,正常對照組小鼠暴露于室內空氣中[8]。

1.3.2 給藥方法

造模第2 天開始給藥。 根據文獻[9]及預實驗結果確定各組小鼠給藥劑量,紅景天苷高劑量組和低劑量組小鼠分別采用50 mg/kg、25 mg/kg 的紅景天苷溶液(臨用前用蒸餾水配置)灌胃,陽性對照組采用10 mg/kg 地塞米松注射液灌胃。 正常對照組和模型組小鼠灌胃等量生理鹽水。 各組小鼠均每天給藥1 次,連續7 d。

1.3.3 肺濕干重比(W/D)和血氧分壓(PaO2)

張連長安慰道:“不要急嘛,我也很內疚啊!實際情況是,連里是派了爬犁來接我們的,但接連下了幾天雨,路被水淹了,爬犁只能在半道迎我們了。我們呢,再走過塔頭甸,就能與連隊的爬犁會合了。”

處死小鼠,分離其右上肺葉,記錄濕重(W),隨后放入80℃恒溫干燥箱烘干,24 h 后稱重,記為干重(D),濕重與干重之比即為W/D。 收集各組小鼠外周動脈血,采用血氣分析儀檢測小鼠血氧分壓(PaO2)。

1.3.4 HE 染色

肺組織4%多聚甲醛固定,制作石蠟組織切片,常規脫蠟復水,行HE 染色觀察小鼠肺組織病理變化。

1.3.5 ELISA 檢測

取小鼠肺組織,剪碎后置于組織研磨器中,加入預冷PBS 緩沖液于冰盒上研磨成勻漿,10 000 r/min 離心10 min,吸取上清即為待測樣品,嚴格按照試劑盒說明書檢測 TNF-α、IL-1β、IL-6、MDA 含量和SOD 活性。

1.3.6 SOD 活性和MDA 含量測定

取小鼠肺組織,剪碎后置于組織研磨器中,加入預冷PBS 緩沖液于冰盒上研磨成勻漿,10 000 r/min 離心10 min,吸取上清即為待測樣品,-80℃保存。 ①SOD 活性檢測:取待測樣品20 μL,依次加入SOD 檢測緩沖液、WST-8 工作液和反應啟動工作液,37℃孵育30 min,450 nm 波長測吸光度(A)值,根據標準曲線計算待測樣品的SOD 酶活力(U/mg)。 ②MDA 含量檢測:取待測樣品 100 μL,加入工作液、蒸餾水和待測樣品,置100℃水浴中孵育60 min,冷卻后10 000 r/min 離心10 min,取上清液,測定各組樣品 450 nm、532 nm 和 600 nm 處 A 值,計算ΔA450=A450測定-A450空白,ΔA532=A532測定-A532空白,ΔA600=A600測定-A600空白,MDA 含量(nmol/mg)= 5×[12.9×(ΔA532-ΔA600)-2.58×ΔA450]。

1.3.7 Western blot

取小鼠肺組織,BCA 法確定樣品的蛋白濃度,按照每孔30 μg 的上樣量進行SDS-PAGE 凝膠電泳分離蛋白,電轉至PVDF 膜,將PVDF 膜放入各一抗稀釋液(1 ∶1 000)中 4℃孵育過夜,TBST 清洗后放入二抗(1 ∶2 000)中37℃孵育2 h,洗膜,加發光液,置凝膠成像系統進行曝光,計算目的蛋白灰度值,并計算蛋白的相對表達量(蛋白相對表達量=目的蛋白灰度值/ GAPDH 蛋白灰度值)。

1.3.8 qRT-PCR

提取各組小鼠肺組織總RNA,逆轉錄成cDNA,按照說明書進行PCR 擴增。 PCR 引物序列見表1。

表1 基因引物序列Table 1 Primer sequences of genes

1.4 統計學方法

應用SPSS 25.0 統計軟件分析數據,實驗重復3次,計量資料以平均數±標準差()表示,多樣本比較采用單因素方差分析,兩樣本比較采用SNK-q檢驗。P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 紅景天苷對肺組織W/D 值和PaO2 水平的影響

模型組、陽性對照組、紅景天苷高劑量組和低劑量組小鼠肺組織W/D 值顯著高于正常對照組,PaO2水平顯著低于正常對照組;陽性對照組、紅景天苷高、低劑量組小鼠肺組織W/D 值顯著低于模型組,PaO2水平顯著高于模型組(P<0.05);與陽性對照組比較,紅景天苷高劑量組小鼠肺組織W/D值和PaO2水平差異無統計學意義(P>0.05),紅景天苷低劑量組小鼠肺組織W/D 值升高,PaO2水平降低(P<0.05)。 見表 2。

表2 各組小鼠肺組織W/D 值和PaO2 水平的比較(,n=10)Table 2 Comparison of W/D value and PaO2 level of lung tissues of mice in each group

表2 各組小鼠肺組織W/D 值和PaO2 水平的比較(,n=10)Table 2 Comparison of W/D value and PaO2 level of lung tissues of mice in each group

注:與正常對照組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05;與陽性對照組比較,△P<0.05。 下同。Note. Compared with the normal control group,*P<0.05. Compared with the model group,#P<0.05. Compared with the positive control group,△P<0.05. The same as below.

組別Groups 劑量(mg/kg)Dose 肺組織濕干重比W/D 血氧分壓(mmHg)PaO2正常對照組 Normal control / 4.81±0.32 123.65±9.61模型組 Model / 10.13±0.52* 68.76±9.14*陽性對照組 Positive control 10 5.96±0.39*# 115.27±5.36*#紅景天苷高劑量組Salidroside high-dose 50 5.85±0.45*# 113.12±6.81*#紅景天苷低劑量組 Salidroside low-dose 25 8.36±0.43*#△ 88.97±7.52*#△F 值F value / 13.65 21.54 P 值P value / <0.01 <0.01

2.2 紅景天苷對小鼠肺組織病理學形態的影響

正常對照組小鼠肺組織結構正常。 模型組小鼠肺組織結構紊亂,肺泡壁明顯增厚,失去正常形態,并存在明顯炎癥浸潤現象,肺間質可見膠原蛋白沉淀;與模型組比較,陽性對照組、紅景天苷高劑量組小鼠肺組織病變得到顯著改善,炎癥細胞浸潤和膠原蛋白沉積的現象相對較少,紅景天苷低劑量組小鼠肺泡結構基本完整,但肺泡壁增厚明顯,肺組織間仍存在大量的炎癥細胞。 見圖1。

圖1 各組小鼠肺組織病理學形態比較Note. A, Normal control group. B, Model group. C, Positive control group. D, Salidroside high-dose group. E, Salidroside low-dose group.Figure 1 Comparison of histopathological morphology of the lungs of mice in each group

2.3 紅景天苷對肺組織 TNF-α、IL-1β、IL-6 含量的影響

模型組、陽性對照組、紅景天苷高、低劑量組小鼠肺組織中 TNF-α、IL-1β、IL-6 含量均高于正常對照組(P<0.05);陽性對照組、紅景天苷高、低劑量組TNF-α、IL-1β、IL-6 含量均顯著低于模型組(P<0.05);與陽性對照組比較,紅景天苷高劑量組TNF-α、IL-1β、IL-6 含量差異無統計學意義(P>0.05),紅景天苷低劑量組 TNF-α、IL-1β、IL-6 的含量有所增加(P<0.05)。 見表 3。

表3 各組小鼠肺組織中炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6 含量比較(,n=3)Table 3 Comparison of the levels of inflammatory factors TNF-α, IL-1β and IL-6 in the lung tissues of mice in each group

表3 各組小鼠肺組織中炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6 含量比較(,n=3)Table 3 Comparison of the levels of inflammatory factors TNF-α, IL-1β and IL-6 in the lung tissues of mice in each group

組別Groups劑量(mg/kg)Dose TNF-α(ng/mL)IL-1β(pg/mL)IL-6(ng/mL)正常對照組 Normal control / 5.88±1.25 12.33±2.01 18.61±2.15模型組 Model / 82.55±6.27* 62.63±4.25* 145.25±8.11*陽性對照組 Positive control 10 32.41±3.25*# 20.55±2.54*# 58.84±5.24*#紅景天苷高劑量組Salidroside high-dose 50 33.54±3.39*# 21.26±2.87*# 59.97±5.39*#紅景天苷低劑量組Salidroside low-dose 25 63.28±4.96*#△ 35.12±3.44*#△ 101.52±7.54*#△F 值F value / 24.26 19.72 13.58 P 值P value / <0.01 <0.01 <0.01

2.4 紅景天苷對肺組織SOD 活性和MDA 含量的影響

模型組、陽性對照組、紅景天苷高、低劑量組小鼠肺組織中SOD 活性均低于正常對照組,MDA 含量均高于正常對照組(P<0.05);陽性對照組、紅景天苷高、低劑量組SOD 活性顯著高于模型組,MDA含量顯著低于模型組(P<0.05);紅景天苷高劑量組小鼠肺組織SOD 活性和MDA 含量與陽性對照組比較無顯著差異(P>0.05);與陽性對照組比較,紅景天苷低劑量組小鼠肺組織SOD 活性降低,MDA 含量增加(P<0.05)。 見表 4。

表4 各組小鼠肺組織SOD 活性和MDA 含量比較(,n=3)Table 4 Comparison of SOD activity and MDA content in lung tissues of mice in each group

表4 各組小鼠肺組織SOD 活性和MDA 含量比較(,n=3)Table 4 Comparison of SOD activity and MDA content in lung tissues of mice in each group

組別Groups 劑量(mg/kg)Dose SOD(U/mg) MDA(nmol/mg)正常對照組 Normal control / 60.65±4.65 12.25±2.47模型組 Model / 28.95±3.49* 31.89±3.18*陽性對照組 Positive control 10 51.21±4.99*# 16.48±2.54*#紅景天苷高劑量組Salidroside high-dose 50 49.98±6.15*# 15.99±2.01*#紅景天苷低劑量組 Salidroside low-dose 25 39.73±3.82*#△ 24.76±2.69*#△F 值F value / 14.19 13.85 P 值P value / <0.01 <0.01

2.5 紅景天苷對肺組織 Notch1、HERP、HES1 蛋白表達的影響

模型組、陽性對照組、紅景天苷高、低劑量組小鼠肺組織Notch1、HERP、HES1 蛋白表達均低于正常對照組(P<0.05);陽性對照組、紅景天苷高劑量組和低劑量組小鼠肺組織Notch1、HERP、HES1 蛋白表達均高于模型組(P<0.05);與陽性對照組比較,紅景天苷高劑量組Notch1、HERP、HES1 蛋白表達差異無統計學意義(P>0.05),紅景天苷低劑量組Notch1、HERP、HES1 蛋白表達降低,差異均有統計學意義(P<0.05)。 見圖2,表 5。

表5 各組小鼠肺組織中Notch 信號通路蛋白相對表達水平比較(,n=3)Table 5 Comparison of relative expression levels of Notch signaling pathway proteins in lung tissues of mice in each group

表5 各組小鼠肺組織中Notch 信號通路蛋白相對表達水平比較(,n=3)Table 5 Comparison of relative expression levels of Notch signaling pathway proteins in lung tissues of mice in each group

組別Groups 劑量(mg/kg)Dose Notch1 HERP HES1正常對照組 Normal control / 0.99±0.08 1.05±0.09 1.09±0.08模型組 Model / 0.22±0.03* 0.39±0.03* 0.29±0.03*陽性對照組 Positive control 10 0.62±0.05*# 0.71±0.05*# 0.54±0.05*#紅景天苷高劑量組Salidroside high-dose 50 0.59±0.04*# 0.69±0.06*# 0.57±0.04*#紅景天苷低劑量組Salidroside low-dose 25 0.38±0.03*#△ 0.50±0.04*#△ 0.38±0.03*#△F 值F value / 10.68 11.88 21.67 P 值P value / <0.01 <0.01 <0.01

圖2 Western blot 法檢測各組小鼠肺組織中Notch 信號通路相關蛋白表達情況Note. A, Normal control group. B, Model group. C,Positive control group. D, Salidroside high-dose group. E,Salidroside low-dose group.Figure 2 Western blot method to detect the expressions of Notch signaling pathway related proteins in the lung tissues of each group of mice

2.6 紅景天苷對肺組織 Notch1、HERP、HES1 mRNA 表達水平的影響

模型組、陽性對照組、紅景天苷高、低劑量組小鼠肺組織 Notch1、HERP、HES1 mRNA 表達均低于正常對照組(P<0.05);陽性對照組、紅景天苷高劑量組和低劑量組小鼠肺組織Notch1、HERP、HES1 mRNA 表達均高于模型組(P<0.05);與陽性對照組比較,紅景天苷高劑量組 Notch1、HERP、HES1 mRNA 表達差異無統計學意義(P>0.05),紅景天苷低劑量組 Notch1、HERP、HES1 mRNA 表達降低,差異均有統計學意義(P<0.05)。 見表6。

表6 各組小鼠肺組織中Notch1、HERP、HES1 mRNA 表達水平比較(,n=3)Table 6 Comparison of Notch1, HERP and HES1 mRNA expression levels in lung tissues of mice in each group

表6 各組小鼠肺組織中Notch1、HERP、HES1 mRNA 表達水平比較(,n=3)Table 6 Comparison of Notch1, HERP and HES1 mRNA expression levels in lung tissues of mice in each group

組別Groups 劑量(mg/kg)Dose Notch1 HERP HES1正常對照組 Normal control / 1.75±0.15 0.95±0.09 0.81±0.06模型組 Model / 1.01±0.11* 0.38±0.02* 0.25±0.02*陽性對照組 Positive control 10 1.62±0.13*# 0.75±0.04*# 0.66±0.05*#紅景天苷高劑量組Salidroside high-dose 50 1.59±0.18*# 0.70±0.08*# 0.68±0.04*#紅景天苷低劑量組Salidroside low-dose 25 1.23±0.09*#△ 0.48±0.03*#△ 0.39±0.02*#△F 值F value / 11.95 22.38 16.43 P 值P value / <0.01 <0.01 <0.01

3 討論

在臨床治療中,氧療是必不可少的急救措施,但長時間暴露在高濃度氧環境下可引起氧中毒,使肺組織產生并釋放大量炎性細胞介質,同時使機體呈現氧化應激狀態,肺泡毛細血管通透性增加,最終發展為不可逆損傷[10]。 Notch 信號通路是一種高度保守的傳導途徑,在肺穩態、肺損傷和修復過程中起關鍵作用,尤其與慢性阻塞性肺疾病(COPD)、哮喘、肺纖維化、肺動脈高壓(PAH)、肺癌等多種肺部疾病的發病機制密切相關[11]。 Bai 等[5]研究發現,增強Notch1 和HERP 表達可抑制高氧誘導的Ⅱ型肺泡上皮細胞凋亡和氧化應激損傷,抑制活性氧的產生。 研究證明,紅景天苷具有抗衰老、抗炎、抗氧化、抗癌和保肝特性,同時具有高效低毒的特點[12]。 Lan 等[13]研究發現,紅景天苷通過上調SIRT1 抑制NF-κB/HMGB1 途徑預防并減輕敗血癥誘導的小鼠急性肺損傷,改善肺水腫和脂質過氧化,降低死亡率。 然而,紅景天苷對高氧誘導的小鼠肺損傷是否具有保護和治療作用尚不清楚,仍需進一步探討。

肺損傷是臨床急性呼吸衰竭的重要因素,目前比較公認的病因是肺內炎癥因子釋放增加,損傷肺泡上皮細胞和血管內皮細胞,觸發氧化應激反應,導致肺功能受損、低氧合、高生理死腔,進而發展為呼吸衰竭[14]。 Lu 等[15]研究證明,紅景天苷可降低脂多糖誘導的小鼠急性肺損傷模型W/D 值,改善肺組織病理學改變,顯著抑制 TNF-α、IL-1β 和 IL-6等炎癥因子的產生。 本研究發現,紅景天苷可顯著降低小鼠肺組織W/D,升高PaO2水平,降低肺組織炎癥因子 TNF-α、IL-1β、IL-6 的含量,同時顯著改善小鼠肺組織病理學改變,其中紅景天苷高劑量組和陽性對照組小鼠肺組織肺泡結構基本正常,僅有少量炎癥細胞浸潤,幾乎無膠原蛋白沉淀。 在肺損傷中,炎癥反應和氧化應激反應是其基本病理過程[16]。 陳少忠等[17]研究發現,紅景天苷注射液能夠增加膿毒性休克肺損傷大鼠抗氧化酶的活性,減少脂過氧化產物的生成,提高機體抗氧化應激的能力。 本研究顯示,紅景天苷可提高肺組織 SOD 活性,降低MDA 含量,且高劑量紅景天苷的作用與陽性藥物的作用比較無顯著差異,表明高劑量紅景天苷對小鼠高氧肺損傷具有保護作用,可顯著抑制氧化應激反應。

肺損傷的發病機制復雜,有研究證明,Notch 信號通路在肺損傷的發生發展進程中具有重要的調控作用[18]。 馬建齊等[19]研究發現,姜黃素通過抑制Notch2 和HES1 的表達減輕膿毒癥大鼠急性肺損傷的炎癥反應。 但鄧健[20]研究發現,高氧暴露可使 Notch1、HERP、HES1 表達下調,肺組織出現相應的病理損傷,促進Notch 信號通路的表達則可發揮藥物對高氧肺損傷的保護作用。 本研究結果顯示,紅景天苷可增加高氧誘導型小鼠肺損傷模型Notch信號通路 Notch1、HERP、HES1 蛋白和 mRNA 表達水平,與陽性對照組比較,紅景天苷高劑量組Notch1、HERP、HES1 的表達水平差異無統計學意義,表明紅景天苷可能通過調控高氧肺損傷模型Notch 信號通路的表達達到肺損傷的保護作用。 另外,已有毒理學研究證明,紅景天苷在動物實驗中未出現遺傳毒性,副作用低,安全性良好,對呼吸系統具有顯著保護作用,是臨床治療急性肺損傷的潛在單體藥物,具有廣闊的應用前景[21]。

綜上所述,紅景天苷能夠減輕高氧誘導的小鼠肺損傷,其機制可能與Notch 信號通路表達變化有關。