槲皮素對口腔癌Tca-8113 細胞增殖、遷移和侵襲的影響及PI3K/AKT 信號通路的調控作用

肖蘭飛高繼萍閆曉如王曉堂續國強宋國華

(1.山西醫科大學實驗動物中心,實驗動物與人類疾病動物模型山西省重點實驗室,太原 030001;2.山西醫科大學附屬精神衛生醫院,太原 030001)

口腔癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一,死亡率高,預后差[1]。 盡管口腔癌的預后和治療取得了很大的進展,但其 5 年生存率仍低于 63%[2]。 因此,尋找療效確切的抗口腔癌藥物,可能成為提高口腔癌治愈率的重要研究方向。 近年來,已有研究表明傳統中醫藥在腫瘤治療中發揮著重要的作用[3]。 槲皮素是廣泛存在于我們日常飲食中一種植源性黃酮類化合物,它通過促凋亡作用和抑制多種癌癥的發生發展顯示出抗癌潛能[4]。 研究發現,槲皮素可通過線粒體和內質網信號通路誘導人口腔癌SAS 細胞凋亡[5]。 也有研究表明,槲皮素在體外實驗可有效抑制口腔癌SCC-25 細胞生長、遷移和侵襲,其分子機制是通過細胞周期阻滯和線粒體介導的凋亡實現的[6]。 PI3K/AKT 與癌細胞增殖和凋亡、周期調控、侵襲轉移以及化放療抗拒密切相關,在腫瘤的發生發展中起關鍵作用[6-8]。 目前尚無PI3K/AKT 信號通路在槲皮素對口腔癌細胞生物學行為中作用的研究。 因此,本研究探討了槲皮素對口腔癌Tca-8113 細胞增殖、遷移和侵襲功能的影響及對PI3K/AKT 信號通路的調控作用,旨在為口腔癌的治療提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 實驗細胞

本實驗所使用的人口腔癌細胞系Tca-8113 購自武漢博士德生物公司。

1.2 主要試劑與儀器

槲皮素購自上海Acmec 公司;CCK-8 試劑盒購自上海翊圣公司;Transwell 小室與Matrigel 基底膜基質均購自美國Corning 公司;TRIzol、PrimeScriptTMRT Master Mix (Perfect Real Time)與TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ (Tli RNaseH Plus)均購自日本TaKaRa 公司;RIPA 增強型裂解液、BCA 蛋白定量試劑盒、SDS-PAGE 凝膠試劑盒均購自武漢博士德生物公司;anti-PTEN、anti-AKT 和 anti-FOXO1 一抗均購自 Proteintech 公司; anti-p-AKT 和 anti-p-FOXO1 購 自 Wanleibio 公 司;anti-BCL2L11 和 βactin 均購自美國CST 公司,貨號分別為:22034-1-AP、10176-2-AP、18592-1-AP、WLP001a、WL03634、2933、4970 T。 CO2細胞培養箱購自日本 Sanyo 公司;微孔分光光度計Epoch 購自美國Bio-tek 公司;實時熒光定量PCR 儀Step One Plus 購自美國ABI公司;普通PCR 儀和蛋白垂直電泳儀購自美國Bio-Rad 公司;化學發光成像儀購自英國Yngene 公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞系的選擇

選用3 種不同分化類型的口腔癌細胞系進行了槲皮素處理預實驗。 與其余兩種細胞系相比,Tca-8113 作為一種低分化的口腔癌細胞系,其對于槲皮素的處理更加敏感,因此我們選用Tca-8113 作為實驗對象。 此外,Tca-8113 作為經典的細胞系也在口腔癌研究中被廣泛應用[9]。

1.3.2 細胞的培養與處理

將Tca-8113 細胞培養在添加有10%胎牛血清,100 U/mL 青霉素和 100 μg/mL 鏈霉素的 DMEM 培養基中,培養溫度為37℃,二氧化碳含量為5%。 將細胞分為對照組和槲皮素處理組,槲皮素處理組細胞依據文獻報道,選擇槲皮素的最佳作用濃度為50 μmol/L[10],不做任何處理的細胞(即0 μmol/L 槲皮素)作為對照組。

1.3.3 細胞增殖檢測

胰酶消化細胞后,調整細胞個數為5×104/mL。用移液器吸取100 μL 細胞懸液加入96 孔板中,藥物處理24、48、72 h,每組設置 5 個復孔。 處理結束后每孔加入CCK-8 溶液10 μL 后置于37℃培養箱孵育 2 h。 酶標儀檢測 450 nm 光吸收度(optical density, OD),細胞增殖能力根據下述公式計算:細胞增殖能力=[(實驗孔-空白孔)/(對照孔-空白孔)]×100%。

1.3.4 Transwell(添加基質膠)檢測細胞的遷移(侵襲)能力

用PBS 洗滌兩次經處理的細胞,胰蛋白酶消化離心后用不含FBS 的培養基重懸細胞,調整細胞個數為 5×103/mL。 用移液器移取 200 μL 細胞懸液加入 Transwell 小室中,700 μL 含有 10% FBS 的培養基加入24 孔板中,共培養24 h。 培養結束后,用棉簽從小室中除去未遷移的細胞,PBS 洗滌一次,4%多聚甲醛固定30 min,隨后0.1%結晶紫染液染色15~30 min,PBS 緩慢輕柔的洗滌一次。 每個小室隨機選取5 個視野進行統計學分析。

1.3.5 qRT-PCR 檢測相關mRNA 表達情況

將培養在六孔板中藥物處理后的細胞加入TRIzol 裂解,裂解完成后提取總RNA,測定濃度與純度后根據反轉錄試劑盒的說明將總RNA 反轉錄成cDNA,最后取反轉錄完成的 cDNA 進行 qRTPCR 反應,以GAPDH作為內參。 引物序列見表1。

表1 各基因引物序列Table 1 Primer sequences of genes

1.3.6 Western blot 檢測處理前后相關蛋白表達情況

將培養在六孔板中藥物處理后的細胞加入RIPA裂解,裂解完成后離心取上清,使用BCA 試劑盒檢測每組細胞的蛋白濃度,每組取15 μg 蛋白進行SDSPAGE 凝膠電泳,電泳結束后將其轉移至NC 膜,封閉液封閉后加入一抗于4℃孵育過夜,一抗孵育結束后二抗室溫孵育1 h,然后在曝光儀中進行曝光,Image J分析蛋白的表達量,以β-actin 作為內參。

1.4 統計學方法

采用SPSS 19.0 進行統計學分析,以平均數±標準差()表示結果。 采用單因素方差分析(ANOVA)進行組間比較,以P<0.05 認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 槲皮素可抑制口腔癌細胞的生長

圖1 結果顯示,在槲皮素剛作用于Tca-8113 細胞系時,對照組與槲皮素組具有相似的細胞增殖能力;給藥后24 h 細胞的增殖能力較對照組出現下降,直到 48 h 達到最低(P<0.01)。 給藥后 72 h,細胞增殖能力出現一定上升,但與48 h 相比沒有差異(P>0.05),這種現象可能是與隨著藥物作用時間的增加藥效出現降低有關。 從以上數據可以得出,槲皮素對Tca-8113 的增殖可能具有抑制作用,且在48 h 時效果較好,所以據此選用處理48 h 作為后續實驗的作用時間。

圖1 CCK-8 實驗檢測槲皮素對Tca-8113 細胞增殖的影響Figure 1 CCK-8 assay was used to detect the effect of quercetin on Tca-8113 cell proliferation

2.2 槲皮素可抑制口腔癌細胞遷移和侵襲

圖2A 顯示,與對照組相比,槲皮素處理組Tca-8113 細胞遷移的數目減少,說明細胞的遷移能力顯著降低(P<0.001);圖2B 侵襲結果顯示,槲皮素處理組Tca-8113 細胞侵襲的數目也出現下降,說明槲皮素也抑制細胞的侵襲能力(P<0.001),此結果表明槲皮素可以抑制Tca-8113 細胞的遷移與侵襲。

圖2 Transwell(添加基質膠)檢測Tca-8113 細胞的遷移(侵襲)能力Note. A, Transwell assay was used to detect the migration cell number and its statistics of Tca-8113. B, Transwell assay was used to detect the invasion cell number and its statistics of Tca-8113. Compared with control,***P<0.001.Figure 2 Transwell (add matrigel) to detect migration (invasion) ability of Tca-8113 cell

2.3 槲皮素處理前后細胞 PTEN、AKT、FOXO1、BCL2L11 的表達

如圖3A 結果顯示,與對照組相比,槲皮素處理組PTEN和BCL2L11 mRNA 表達水平均顯著上調(P<0.05),但AKT和FOXO1 mRNA 表達水平無顯著差異。 圖3B 和3C 結果顯示槲皮素處理組PTEN和BCL2L11 蛋白表達水平均顯著上調(P<0.05),FOXO1 和AKT 磷酸化水平顯著下調(P<0.01)。

圖 3 PTEN、AKT、FOXO1、BCL2L11 在 Tca-8113 各組細胞中的表達Note. A, The Tca-8113 cell mRNA expression of PTEN、AKT、FOXO1、BCL2L11 determined by qRT-PCR. B, The Tca-8113 cell potein expression of PTEN、AKT、p-AKT、FOXO1、p-FOXO1、BCL2L11 determined by Western blot. C, Statistical analysis of protein expression.Compared with control,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001.Figure 3 Expression of PTEN、AKT、FOXO1、BCL2L11 in Tca-8113 cell

3 討論

口腔鱗狀細胞癌(OSCC)是口腔癌中最為常見的一種類型,由于其發病部位位于口腔,通過外科手術切除病變會嚴重影響患者的美觀,所以亟需一種合理的治療方式[11]。 槲皮素是研究較多的一種中藥單體,具有抗癌的潛力,已成為一種潛在的抗癌治療劑[12]。 槲皮素被認為可以誘導包括口腔癌細胞在內的許多癌細胞的生長抑制和細胞死亡[5,10]。 本研究通過探討槲皮素對口腔癌細胞生物學行為的影響,發現槲皮素可以顯著抑制Tca-8113細胞的增殖、遷移及侵襲,以上研究與以往研究結果一致。

PTEN作為 PI3K/AKT 信號通路重要調控因子,是PI3K/AKT 信號通路的負調控蛋白,能夠抑制PIP3 去磷酸化轉變為PIP2,進而抑制AKT及其下游分子活化,阻止PI3K/AKT 通路激活[13-14]。 已有文獻表明槲皮素可以調控PTEN的表達以及調控PI3K/AKT 通路誘導細胞凋亡[7,15]。 本研究利用qRT-PCR 和 Western blot 檢測了PTEN和AKTmRNA 和蛋白水平表達,結果顯示在槲皮素處理組中,口腔癌Tca-8113 細胞中PTENmRNA 和蛋白表達均上調,相反,AKT磷酸化水平顯著下調。

FOXO1 屬于叉形頭轉錄因子的O 亞型,充當腫瘤抑制因子,調節許多涉及凋亡反應、細胞周期調控、細胞分化和細胞代謝的生物學過程[16]。 作為主轉錄因子,FOXO1 通過PI3K/AKT 信號通路進行調節,然后活化的AKT 促使FOXO1 S256 位點處磷酸化(p-FOXO1),從而驅動自身與14-3-3 二聚體結合,最后FOXO1 從細胞核輸出到細胞質[17-18]。 本研究結果顯示,槲皮素處理組中,FOXO1 在mRNA水平上無顯著差異,但FOXO1 磷酸化水平顯著降低,與 AKT 表達相一致。BCL2L11 是BCL2 家族近年來頗受關注的一個含有BH3 結構域的成員,該結構域對促進凋亡有重要作用,在許多抗腫瘤藥物引起的腫瘤細胞凋亡中都觀察到BCL2L11 表達的升高[19]。 有研究表明磷酸化FOXO1 負調控BCL2L11的表達,當位于BCL2L11 啟動子附近的兩個保守的FOXO1 結合位點發生突變以防止FOXO1 結合時,這一點就基本消失了,證明了BCL2L11 基因是FOXO1 直接的靶標[20-22]。 本研究結果顯示槲皮素處理組BCL2L11 mRNA 和蛋白水平表達均顯著上調。 這提示我們槲皮素對PI3K/AKT 信號通路具有負調控作用。

綜上所述,槲皮素可抑制口腔癌Tca-8113 細胞增殖、遷移及侵襲能力,其機制可能是通過上調PTEN的表達,負調控PI3K/AKT 通路減弱FOXO1的磷酸化水平,進而引起BCL2L11 的表達增加實現的。