膠質纖維酸性蛋白在新疆哈薩克羔羊腸道內的分布研究

彭凡洋，冷青文

（石河子大學 動物科技學院，新疆 石河子 832003）

膠質纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）是星形膠質細胞結構中的主要IF蛋白[1]，能夠維持神經元的結構，參與細胞內構建、物質轉運及信息傳遞等活動[2]。GFAP的表達量與中樞神經系統發育和星形膠質細胞的增殖分化有關。正常狀態下，GFAP免疫反應受星形膠質細胞的動力調節[3]；當機體遭受損傷后，GFAP的表達能促進膠質細胞增生。成熟的腸神經膠質細胞（enteric glial cells，EGCs）內GFAP的表達水平與外界損傷刺激以及EGCs的功能狀態密切相關[2]。因此，GFAP被認為是EGCs活化的標記物[4]。

EGCs是腸神經傳遞和處理信息的中心，其含有神經遞質前體，并且能夠表達神經遞質受體。此外，EGCs能夠維持黏膜屏障的完整性，對IEC的生長調節起關鍵作用。在基因修飾的小鼠模型中，切除腸膠質細胞基因的小鼠暴發了由腸上皮屏障破壞引起的急性腸道炎癥[5-7]。研究表明[8]，來自正常小鼠黏膜的腸膠質細胞能夠表達神經激肽A和SP，兩者都可能作用于免疫細胞和上皮細胞。由此可見，EGCs能夠產生細胞因子與其他免疫調節物質，進而調節機體的非特異性黏膜防御功能[9]。

近年來，EGCs在調節腸道健康和慢性疾病上發揮了重要作用，已成為科研人員的研究熱點。本試驗通過觀察新疆哈薩克羔羊腸道中GFAP的分布特征，為綿羊EGCs的分布與功能提供新的參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

試驗選取9只3月齡的新疆哈薩克羔羊，雌雄不限，平均體重21.2 kg/只。用抹脖法放血屠宰，迅速剖開腹腔，分別切取十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結腸和直腸1～2 cm組織塊，用0.9%生理鹽水漂洗，再置于4%多聚甲醛固定液（0.1 mol/L，pH7.2）中固定24 h。常規石蠟包埋，制備連續切片，厚度5 μm，干燥后保存備用。

1.2 主要試劑

免疫組化（IHC）試劑盒套裝（抗兔）；GFAP兔單克隆抗體；生物素標記羊抗兔IgG抗體；試劑均購自北京博奧森生物技術有限公司。

1.3 免疫組織化學染色

免疫組化SABC-DAB染色按照試劑盒說明書進行操作，石蠟切片脫蠟水化，用0.01 mol/L PBS緩沖液沖洗3次，每次5 min。置于檸檬酸鹽抗原修復緩沖液中用微波爐熱修復，冷卻至室溫后取出。在室溫下用內源性過氧化物酶阻斷劑孵育30 min。切片用山羊血清37℃封閉20 min。擦干切片上多余液體，滴加一抗（1∶500）后切片于濕盒37℃孵育1～2 h，同時用PBS緩沖液作一抗的陰性對照組，0.01 mol/L PBS緩沖液沖洗3次，每次5 min。滴加生物素標記的羊抗兔IgG后切片于濕盒37℃孵育20 min，用0.01 mol/L PBS緩沖液沖洗3次，每次5 min。滴加SABC試劑后切片于濕盒37℃孵育20 min，用0.01 mol/L PBS緩沖液沖洗3次，每次5 min。DAB顯色：顯微鏡下控制時間，暗處反應3～5 min，水洗；用蘇木精復染1～5 min，水洗，置于溶液中脫水透明后用中性樹脂封片。在光學顯微鏡（×100）下鏡檢，并用圖像分析軟件Image-Pro Plus 6.0拍照分析。免疫組織化學染色結果描述為細胞著色無、弱（淡黃）、中（棕黃）、強（棕褐）四級。

2 結果

2.1 GFAP在哈薩克羔羊小腸中的分布特點

GFAP在哈薩克羔羊小腸中的分布見圖1。由圖1A可知，GFAP在十二指腸黏膜上皮層呈不規則的團塊狀分布，為強陽性；在黏膜固有層呈陽性分布；在固有肌層呈點狀分布，為弱陽性。由圖1B可知，GFAP在空腸黏膜上皮層呈片狀分布，為強陽性；在黏膜固有層也呈強陽性分布；在固有肌層呈點狀分布，為弱陽性。由圖1C可知，GFAP在回腸黏膜上皮層呈強陽性分布；在黏膜固有層也呈強陽性分布；在固有肌層呈弱陽性分布。

圖1 GFAP在小腸各段的表達

2.2 GFAP在哈薩克羔羊大腸中的分布特點

GFAP在哈薩克羔羊大腸中的分布見圖2。由圖2D可知，GFAP在盲腸黏膜上皮層呈不規則的片狀分布，為強陽性；在黏膜固有層呈強陽性分布；在固有肌層呈點狀分布，為弱陽性。由圖2E可知，GFAP在結腸黏膜上皮層呈強陽性分布；在黏膜固有層呈不連續的片狀分布，為強陽性；在固有肌層呈弱陽性分布。由圖2F可知，GFAP在回腸黏膜上皮層呈強陽性分布；在黏膜固有層也呈強陽性分布；在固有肌層呈弱陽性分布。

圖2 GFAP在大腸各段的表達

2.3 GFAP在哈薩克羔羊各個腸段的光密度值比較

比較GFAP在哈薩克羔羊腸道各個腸段的OD值，結果見圖3。在羔羊小腸中，十二指腸GFAP的OD值最大，空腸與回腸次之；在羔羊大腸中，結腸GFAP的OD值最大，直腸與盲腸次之；羔羊小腸的GFAP的OD值顯著高于大腸（P＜0.05）。

圖3 哈薩克羔羊腸道GFAP的平均光密度

3 討論

GFAP由432個氨基酸構成，相應的分子量為49.8 kDa，是一種不溶性的單體蛋白[10]。在腸道中，GFAP被認為是成熟EGCs的標記物[11]。越來越多的研究表明，EGCs分泌的GFAP可以調節腸道屏障功能。Costantini等[12]發現，通過刺激表達GFAP可以預防小鼠的回腸通透性增加。用藥物治療EGCs誘導的小鼠結腸炎，可以降低EGCs中GFAP的表達，并且減輕小鼠的炎癥反應[13]。研究表明，IBD患者腸道的GFAP表達顯著上升[14-16]。因此，GFAP的表達量在一定意義上反映了EGCs的損傷程度。

本研究發現，在新疆哈薩克羔羊腸道中，GFAP在各個腸段均有陽性反應，且主要表達于小腸段，表明在羔羊腸道中EGCs不僅分布廣泛，而且可能參與調節羔羊腸道的分泌和吸收功能。EGCs是腸神經系統的主要成分，與腸神經結構緊密相連，并且分布在不同的腸道層內[17]。它具有抗原提呈作用，協同抗原激活腸道細胞免疫系統反應[18]，改善腸黏膜屏障功能。羔羊腸道中EGCs的分布特點可能與腸黏膜屏障的功能有關，本研究結果表明，GFAP在羔羊腸道黏膜上皮層和黏膜固有層呈強陽性分布，在固有肌層呈弱陽性分布，表明EGCs可能既參與羔羊腸道的消化吸收功能，又參與腸道屏障的免疫反應。劉敬賢等[19]研究發現，脊髓受損的大鼠用IL-1β干預后，信號通路JAK2-STAT3被活化，體內GFAP和微支肽表達上升。而IL-6可對STAT3磷酸化施以調控，同時結合GFAP基因啟動子，加速體內神經元以及EGCs的增殖[20]。由此可知，EGCs除了能支持腸神經元外，還能促進細胞因子的分泌，緩解腸道炎癥，增強機體的腸黏膜屏障功能。

4 結論

GFAP在新疆哈薩克羔羊的各個腸段中均有分布，以小腸為主；在羔羊的腸黏膜上皮層和黏膜固有層呈強陽性分布，在固有肌層呈弱陽性分布；EGCs在羔羊腸道中的分布范圍廣泛，可能參與調節腸道的諸多生理功能。