南極磷蝦油改善衰老小鼠抗氧化能力的作用研究

劉小芳，宮玉雪，田良良，于源，苗鈞魁，冷凱良*

（1.中國水產科學研究院黃海水產研究所，農業農村部極地漁業開發重點實驗室，山東 青島 266071；2.中國水產科學研究院東海水產研究所，上海 200090）

衰老是一種復雜的自然現象，通常表現為機體的功能衰退、對環境的抵抗力減弱、代謝緩慢、應激反應遲鈍等[1-2]。 目前針對衰老機理已有較多報道，包括免疫學說、自由基學說、蛋白質合成差錯累積學說、線粒體損傷學說及端粒假說等[3]。 自由基增多和蛋白質羰基化增加是目前公認的導致機體衰老發生發展的主要原因。 衰老不可逆轉，但可通過膳食干預抗氧化物質，提高機體抗氧化能力，清除體內過量自由基，減少其對細胞和組織的破壞，延緩衰老進程[4]。

南極磷蝦（Euphausia superba）是一種生活在南極海域的小型甲殼類浮游動物，資源蘊藏量巨大，生物量達到6.5 億噸～10 億噸， 具有打造我國第二個遠洋漁業的巨大潛力[5]。 南極磷蝦油是目前南極磷蝦陸基加工最重要的高值產品形式，其是從南極磷蝦中提取而來的油脂， 富含磷脂、 二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）和二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）等多不飽和脂肪酸以及蝦青素等天然抗氧化物質[6]。 目前關于南極磷蝦油在預防和治療心腦血管疾病、改善腦細胞功能、改善骨質疏松、抑制炎癥等方面的功能已有較多報道[6-7]，但針對其體內抗氧化效果，特別是有效劑量方面尚缺少充足數據支持。 綜上，本研究通過構建D-半乳糖致衰老小鼠模型，觀察不同劑量南極磷蝦油干預對衰老小鼠血液中自由基氧化損傷和蛋白質羰基化相關生化指標的影響，探討南極磷蝦油的抗氧化作用，以期為南極磷蝦油相關功能食品開發提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

SPF 級雄性ICR 小鼠，體重25 g～30 g，8～10 周齡，購自斯貝福（北京） 生物技術有限公司， 許可證號：SCXK（京）2019-0010。

南極磷蝦油： 遼漁南極磷蝦科技發展有限公司；D-半乳糖（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；生理鹽水：四川科倫藥業股份有限公司；大豆油：嘉里糧油（天津）有限公司；丙二醛（malondialdehyde，MDA）測定試劑盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）測定試劑盒、還原型谷胱甘肽（reduced glutathione，GSH）測定試劑盒、蛋白質羰基含量測定試劑盒：南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設備

BAS224S-CW 型電子天平：賽多利斯（北京）科學儀器有限公司；Neofuge 15R 型高速冷凍離心機： 上海力申科學儀器有限公司；HH-4 型數顯恒溫水浴鍋：常州智博瑞儀器制造有限公司；UV1102 Ⅱ型紫外可見分光光度計： 上海天美科學儀器有限公司；CMax Plus型酶標儀：美谷分子儀器（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 實驗分組、造模與灌胃

雄性ICR 小鼠50 只，飼養于標準化動物房，環境溫度（25±2）℃，相對濕度50%～60%，晝夜交替。 適應性喂養7 d 后，除正常組（10 只）外，其余小鼠（40 只）均采用頸背部皮下注射D-半乳糖（500 mg/kg bw）造模，注射量為0.1 mL/10 g，每日1 次，正常組注射等體積生理鹽水，連續造模6 周。 造模6 周后，小鼠經眼眶靜脈取血，分離血清測定MDA 含量。 按照MDA 水平將模型小鼠分為模型組、低劑量南極磷蝦油組（低劑量組，50 mg/kg bw）、中劑量南極磷蝦油組（中劑量組，150 mg/kg bw、高劑量南極磷蝦油組（高劑量組，300 mg/kg bw），每組10 只，保證各南極磷蝦油劑量組小鼠血清MDA 起始水平與模型組基本一致。 南極磷蝦油用大豆油稀釋至5、15、30 mg/mL， 按相應劑量灌胃小鼠，灌胃量為0.1 mL/10 g，正常組和模型組小鼠灌胃等體積大豆油，連續灌胃30 d。 給予受試物期間，模型組和各南極磷蝦油劑量組小鼠繼續頸背部皮下注射D-半乳糖，每隔15 d 記錄體重。 實驗結束后，小鼠經12 h 禁食不禁水， 稱重后采尾尖血20 μL 制備4%溶血液，測定GSH 含量。而后小鼠經眼球取血后處死，血液于室溫（25 ℃）靜置30 min 后，4 ℃、4 000 r/min 離心15 min，分離血清，測定MDA、SOD、蛋白質羰基含量等指標。

1.3.2 評價指標測定

MDA、GSH、蛋白質羰基含量和SOD 活力的測定按照試劑盒說明書進行。

1.4 數據統計分析

實驗結果以平均值±標準差形式表示。 采用SPSS 18.0 軟件進行數據統計分析，采用單因素方差分析進行組間比較，以P<0.05 為具有統計學意義上的顯著差異。

2 結果與分析

2.1 南極磷蝦油對小鼠體重的影響

不同實驗組小鼠體重變化數據見表1。

表1 南極磷蝦油對模型小鼠體重的影響（n=10）Table 1 Effects of Antarctic krill oil on the body weights of model mice（n=10）

由表1 可知，各組小鼠初始體重無顯著差異（P＞0.05），經灌胃不同劑量南極磷蝦油后，小鼠體重增長量均較小， 推測與小鼠灌胃時已達到14～16 周齡，發育已成熟且生長趨于穩定有關。 各劑量組小鼠體重增長量與模型組比均無顯著差異（P＞0.05），提示南極磷蝦油對消化道無刺激作用，不影響小鼠正常生長。

2.2 南極磷蝦油對小鼠血清MDA 含量的影響

不同實驗組小鼠血清MDA 含量測定結果見圖1。

圖1 南極磷蝦油對模型小鼠血清MDA 含量的影響Fig.1 Effects of Antarctic krill oil on MDA contents in the serum of model mice

MDA 是脂肪氧化的終產物，其含量可直觀反映機體內脂質過氧化水平。 由圖1 可知，與正常組相比，模型組小鼠血清MDA 含量顯著升高（P＜0.05）。灌胃給予不同劑量南極磷蝦油30 d 后， 小鼠血清MDA 含量出現不同程度的降低。 與模型組相比，低劑量、中劑量、高劑量南極磷蝦油組小鼠血清MDA 含量分別下降了22.98%（P ＞0.05）、43.20%（P ＜0.05）、50.10%（P ＜0.01），表明南極磷蝦油可以通過降低小鼠脂質過氧化程度來保護機體免受氧化損傷。

2.3 南極磷蝦油對小鼠血清SOD 活力的影響

不同實驗組小鼠血清SOD 活力測定結果見圖2。

圖2 南極磷蝦油對模型小鼠血清SOD 活力的影響Fig.2 Effects of Antarctic krill oil on SOD activities in the serum of model mice

SOD 可清除體內氧自由基，維持機體內活性氧含量的動態平衡。 機體內SOD 活力降低，細胞將會發生脂質過氧化反應，產生MDA，誘導細胞發生氧化應激反應，導致細胞凋亡[8]。 由圖2 可知，與正常組相比，模型組小鼠血清SOD 活力極顯著下降（P＜0.01）。 與模型組相比，低劑量、中劑量、高劑量南極磷蝦油組小鼠血清SOD 活力出現不同程度的提高， 分別增加了11.63%（P ＞0.05）、28.61%（P ＜0.05）、36.00%（P ＜0.01），表明南極磷蝦油可以通過提升小鼠機體中SOD 活力來清除體內過多的活性氧自由基，起到保護機體免受氧化損傷的作用。

2.4 南極磷蝦油對小鼠全血GSH 含量的影響

不同實驗組小鼠全血GSH 含量測定結果見圖3。

GSH 是體內重要的非酶性抗氧化劑，其含量高低是衡量機體抗氧化能力大小的重要標志[9]。 由圖3 可知，與正常組相比，模型組小鼠全血GSH 含量極顯著減少（P＜0.01）。與模型組相比，低劑量、中劑量、高劑量南極磷蝦油組小鼠全血GSH 含量出現不同程度的提高， 分別增加了36.13%（P＞0.05）、50.53%（P＜0.05）、60.80%（P＜0.01）， 表明南極磷蝦油可以通過提升小鼠機體中GSH 含量，清除機體中的過氧化物，減輕機體氧化損傷的程度。

圖3 南極磷蝦油對模型小鼠全血GSH 含量的影響Fig.3 Effects of Antarctic krill oil on GSH contents in the whole blood of model mice

2.5 南極磷蝦油對小鼠血清蛋白質羰基含量的影響

不同實驗組小鼠血清蛋白質羰基含量測定結果見圖4。

圖4 南極磷蝦油對模型小鼠血清蛋白質羰基含量的影響Fig.4 Effects of Antarctic krill oil on protein carbonyl contents in the serum of model mice

蛋白質羰基化是蛋白質分子受到自由基攻擊后發生的非酶促不可逆變化， 羰基化蛋白極易相互交聯、聚集為大分子從而降低或失去原有功能。 蛋白質羰基含量是反映機體氧化損傷程度的重要指標[10]。 由圖4 可知，與正常組相比，模型組小鼠血清蛋白質羰基含量顯著升高（P＜0.05）。 與模型組相比，低劑量、中劑量、 高劑量南極磷蝦油組小鼠血清蛋白質羰基含量出現不同程度的降低，分別下降了17.99%（P＞0.05）、28.93%（P＜0.05）、31.55%（P＜0.01），表明南極磷蝦油可有效降低機體自由基含量， 減少蛋白質羰基化的發生，減輕蛋白質功能下降。

3 討論與結論

目前用于抗氧化功能研究的衰老動物模型主要是自然衰老動物和D-半乳糖致衰老動物。已有研究證實，D-半乳糖致衰老動物與自然衰老動物具有較高的一致性，而前者模型具有組間差異小、試驗周期短的優點[11]。本研究采用頸背部皮下注射D-半乳糖建立小鼠過氧化損傷模型，造模6 周后，小鼠血清MDA 含量從（7.55±0.85）nmol/mL 增加到（10.05±0.92）nmol/mL。實驗末期， 模型組小鼠較正常組血清MDA 和蛋白質羰基含量顯著升高（P＜0.05）、血清SOD 活力和全血GSH 含量極顯著降低（P＜0.01），提示D-半乳糖供給過量，導致小鼠體內超常產生活性氧，使體內活性氧產生與消除的平衡狀態遭到破壞，引起小鼠氧化損傷，加速衰老。 不同劑量南極磷蝦油干預后，小鼠血清SOD 活力和全血GSH 含量得到提高、 血清MDA和蛋白質羰基含量出現下降，其中，中劑量（150 mg/kg bw）和高劑量（300 mg/kg bw）干預效果顯著，證明南極磷蝦油能夠有效改善D-半乳糖致衰老動物的氧化損傷。

南極磷蝦油中磷脂含量高達40%以上，EPA 和DHA 含量可達到18%以上，蝦青素含量為60 mg/kg 以上[6，12]。 EPA、DHA 等n-3 系列多不飽和脂肪酸具有良好的抗氧化作用，值得關注的是，區別于傳統魚油制品，EPA、DHA 在南極磷蝦油中更多地以磷脂型式存在[13-14]，生物利用度更高[15-16]，在體內可發揮更優的生理功能。 已有研究證明南極磷蝦EPA/DHA 磷脂能夠有效改善D-半乳糖致衰老小鼠的氧化損傷并修復皮膚衰老癥狀[17]。 蝦青素是目前已知的抗氧化能力最強的類胡蘿卜素[18]，其抗氧化能力高于β-胡蘿卜素、葉黃素、輔酶Q10 和維生素E 等物質，可通過淬滅單線態氧、消除自由基等途徑發揮抗氧化作用[19-20]。 已有研究證明南極磷蝦來源蝦青素提取物能夠有效改善D-半乳糖致衰老小鼠的氧化損傷，且效果優于合成蝦青素[21]。

綜上，南極磷蝦油由于富含多種天然抗氧化營養成分，能夠通過提高機體自由基清除能力、抑制脂質過氧化和蛋白質羰基化， 改善衰老小鼠的抗氧化能力，進而起到延緩衰老的作用。 本研究可為南極磷蝦油在相關功能食品領域的應用提供理論支持。