平喘顆粒對哮喘小鼠肺組織TLR2和TLR4表達的影響*

王玨，李竹英

黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院，黑龍江 哈爾濱 150040

支氣管哮喘（簡稱哮喘）是由多種炎癥細胞及細胞組分相互作用導致的慢性氣道炎癥性疾病，發病過程中受到炎性介質的不斷刺激而觸發氣道壁損傷和氣道結構變化。因此，抑制氣道炎癥反應是防治哮喘的一個重要方向。流行病學顯示，我國哮喘患病人數約4 570萬，總體發病率達4.2%［1-2］。平喘顆粒是國家級名老中醫劉建秋教授傳承前輩思想并結合多年臨床實踐經驗所創立，劉教授認為哮喘慢性持續期的病機根本為“陽虛痰盛”，故以“溫陽益氣，化痰平喘”為核心思想，組方平喘顆粒用于哮喘慢性持續期的臨床治療。前期研究發現，平喘顆粒可通過抑制上皮間質轉化和血管生成、干預上皮細胞自噬與凋亡改善哮喘的病理進程［3-5］。本研究通過觀察平喘顆粒對哮喘小鼠肺組織Toll樣受體2（toll-like receptor2，TLR2）和TLR4表達及相關炎性因子的影響，探討平喘顆粒對哮喘的作用。

1 材料

1.1 動物8周齡健康清潔級雌性BALB/c小鼠30只，體質量（20±2）g，購自遼寧長生生物技術股份有限公司，許可證號：SCXK（遼）2015-0001。

1.2 藥物與試劑平喘顆粒［淫羊藿200 g，太子參150 g，黃芪150 g，五味子150 g，知母100 g，麻黃（炙）100 g，款冬花（炙）150 g，地龍100 g，罌粟殼40 g］（黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院提供，批號：20180723）。白細胞介素-4（interleukin-4，IL-4）、IL-5、IL-13 ELISA試劑盒（杭州聯科生物技術股份有限公司，批號分別為：70-EK204/2-96、70-EK205-96、70-EK213/2-96）；卵清蛋白（ovalbumin，OVA）（上海生工生物技術有限公司，批號：A003056-0100）；烏拉坦（美國Sigma公司，貨號：U2500-100G）；40 ng·L-1多聚甲醛（上海碧云天生物技術有限公司，貨號：P0099）；蘇木精、伊紅染色液（北京索萊寶生物科技有限公司，貨號分別為：H8070、G1100）；PVDF膜（上海谷研生物技術有限公司，批號：GOY-C3192）；細胞裂解液（上海梵態生物技術有限公司，批號：FT-LG1227）；PMSF（北京伊塔生物技術有限公司，批號：YT1705）；BCA蛋白濃度測定試劑盒、TLR2抗體、TLR4抗體（美國Abcam公司，貨號分別為：ab102536、ab209216、ab22048）；內參β-actin抗體（圣克魯斯生物技術公司，貨號：sc-47778）。

1.3 儀器Proline微量移液器［芬蘭百得實驗室儀器（中國）有限公司］；ELX-800型酶標儀（美國伯騰儀器有限公司）；Lx81型倒置熒光顯微鏡（日本Olymps公司）；OLB-200B型水平搖床（濟南歐萊博科學儀器有限公司）；165-8001型電泳儀（美國Bio-Rad公司）；DYCZ-40D型轉移槽（北京六一儀器廠）；CM69001型-30℃恒冷低溫切片機（德國Leica公司）；DWHL-668型-70℃超低溫冰箱（中科美菱低溫科技股份有限公司）。

2 方法

2.1 動物分組與模型復制將30只BALB/c小鼠隨機分為對照組、模型組、平喘顆粒組，每組10只。模型組和平喘顆粒組采用腹腔注射加霧化OVA致敏液［100μg OVA+1 mg Al（OH）3］制備慢性哮喘小鼠模型［6］，分別于第1天、第14天腹腔注射0.2 mL致敏液，第22天后改用1%OVA溶液進行霧化，激發30 min，每周3次，連續激發8周。對照組用生理鹽水代替OVA激發，平喘顆粒組從第1次霧化激發的當天開始，每天灌胃給予平喘顆粒藥液，持續給藥8周，激發階段每次激發前1 h灌胃，對照組和模型組給予等體積的生理鹽水灌胃，給藥時間同平喘顆粒組。

2.2 血清中IL-4、IL-5、IL-13水平的檢測于末次激發24 h后，采用20%烏拉坦（5 mg·kg-1）腹腔注射麻醉，摘眼球取血并制備血清，檢測血清中IL-4、IL-5、IL-13水平。

2.3 HE染色觀察肺的病理變化每組隨機選5只小鼠，開胸取小鼠右肺的前葉及中葉部分，分離肺組織，用40 ng·L-1多聚甲醛固定保存。將固定后的組織石蠟包埋后切片，脫蠟，水洗后進行蘇木精-伊紅染色，觀察各組小鼠肺組織的病理學改變。

2.4 Western blot法檢測肺組織TLR2、TLR4的表達每組隨機取5只小鼠的肺組織，提取肺組織總蛋白，進行蛋白質定量，電泳、轉膜、封閉及抗體孵育、曝光。用凝膠圖像處理系統分析目標條帶的灰度值。

2.5 統計學方法用SPSS 22.0軟件進行數據分析，計量數據采用平均值±標準差（±s）表示，組間比較用單因素方差分析（One-Way ANOVA），兩兩比較用LSD檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 小鼠肺組織的病理變化對照組小鼠肺組織及支氣管結構正常，肺泡輪廓清晰；模型組小鼠肺組織及支氣管外周可見大量的炎性細胞浸潤，肺泡結構異常；平喘顆粒組小鼠肺組織上述病理改變減輕，但與對照組仍有差距，肺組織及支氣管外周可見多個中等大小的炎性細胞浸潤灶，肺泡結構不完整。見圖1。

圖1 各組小鼠肺組織病理學損傷（HE，×200）

3.2 小鼠血清中IL-4、IL-5和IL-13水平的檢測與對照組比較，模型組小鼠血清中IL-4、IL-5和IL-13水平明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，平喘顆粒組小鼠血清中IL-4、IL-5和IL-13水平明顯降低（P＜0.05）。見圖2。

圖2 小鼠血清中IL-4、IL-5和IL-13水平

3.3 小鼠肺組織TLR2和TLR4蛋白表達與對照組比較，模型組小鼠肺組織TLR2和TLR4蛋白表達明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，平喘顆粒組小鼠肺組織TLR2和TLR4蛋白表達明顯降低（P＜0.05）。見圖3、圖4。

圖3 各組小鼠肺組織TLR2和TLR4蛋白表達

圖4 各組小鼠肺組織TLR2和TLR4蛋白表達

4 討論

平喘顆粒是黑龍江中醫藥大學自制的中藥制劑，全方共由9味中藥組成。方中麻黃溫通宣肺平喘，淫羊藿入腎經振奮陽氣，二者為君，陽氣通達，肺臟宣散之氣得以肅降，腎臟氣化功能得以恢復。五味子入肺腎二經，斂肺止咳，太子參補脾肺氣陰，兼化痰止咳，黃芪補脾升陽。款冬花宣肺止咳，地龍瀉熱平喘，以上5味中藥共為臣藥。罌粟殼酸澀收斂，可斂肺氣以止咳，同時防止君藥辛散耗氣，為佐藥。知母甘寒養陰，潤肺止咳，可降肺之氣逆，引諸藥歸經，為使藥。方中藥物配伍升降有序、陰陽同補、收散并用，補益氣血、溫化痰濕、宣暢氣機，共奏溫陽益氣、化痰平喘之功。研究表明，麻黃、五味子、款冬花、地龍均具有抗炎、平喘、鎮咳等作用［7-11］。金華良等［12］研究發現，淫羊藿可降低哮喘大鼠肺泡灌洗液中IL-4、IL-5和IL-13水平，從而抑制氣道炎癥。

哮喘的發病機制復雜多變，常伴隨著多種免疫細胞、細胞因子及炎性介質的參與，故免疫調節失衡是哮喘的主要致病因素之一。目前普遍認為哮喘的免疫調節失衡主要為Th1/Th2亞群比例失衡，表現為Th2細胞數目增多和功能亢進。Th2細胞通過產生IL-4、IL-5和IL-13等細胞因子，誘導初始效應細胞如嗜酸性粒細胞和肥大細胞的活化，產生大量的炎癥介質，導致氣道慢性炎癥的發生［13-14］。病理學觀察顯示，平喘顆粒可減輕哮喘小鼠的肺部炎性病變。研究表明，哮喘患者血清中IL-4、IL-13水平與IgE的含量及病情嚴重程度呈正相關性［15-17］。IL-5可增加嗜酸性粒細胞的敏感性，刺激其增殖分化，促進組胺的釋放，導致哮喘的加重［18-19］。本研究發現，平喘顆粒可降低哮喘小鼠血清中IL-4、IL-5和IL-13水平，改善哮喘的炎癥反應。

Toll樣受體是介導天然免疫和獲得性免疫的細胞膜受體，其中以TLR2、TLR4表達范圍最為廣泛，可識別微生物病原體，促進多種炎性細胞及因子的釋放，與哮喘的發生密切相關［20-22］。TLR2表達于多種免疫細胞和氣道上皮細胞中，可通過介導下游的NF-κB通路和NLRP3炎癥小體參與過敏性氣道炎癥［23-24］。研究發現，TLR2激動劑可增加哮喘小鼠Th2類相關因子，如IL-5、IL-13的水平，進而加重哮喘的Th2免疫反應［25-26］。TLR4在哮喘患者體內呈高表達狀態，可誘導氣道上皮細胞、肺泡巨噬細胞等釋放細胞因子及炎性介質，激發T淋巴細胞向Th2方向分化，誘導炎癥的發生［27-28］。研究顯示，TLR4基因敲除可減輕哮喘模型小鼠的氣道炎癥和氣道重塑，其機制可能與調節Th1/Th2及RORγt/Foxp3細胞因子的平衡有關［29-30］。本研究發現，平喘顆粒可降低小鼠肺組織TLR2和TLR4蛋白表達，抑制Th2細胞活化，調節Th1/Th2免疫失衡。

綜上所述，平喘顆粒可緩解哮喘氣道炎癥，其機制可能與調控TLR2、TLR4表達，從而抑制Th2細胞活化有關。哮喘是一種多種病理因素的復雜疾病，本文雖然探討了平喘顆粒在改善氣道炎癥方面的相關機制，但在哮喘作用機制方面仍有許多值得研究的領域，如氣道重塑、氣道高反應性、氧化應激等，平喘顆粒是否與這些作用機制有關，還需要進行深入探索。