外源鈣對(duì)鹽脅迫下羅漢果幼苗生理效應(yīng)的影響

趙 英， 張佳佳， 吳 敏， 鄧 平， 朱宇林*， 黃司翊

（1.玉林師范學(xué)院 生物與制藥學(xué)院，廣西 玉林537000； 2.西北農(nóng)林科技大學(xué) 林學(xué)院，陜西 楊凌712100）

羅漢果（Siraitia grosvenorii）是葫蘆科多年生藤本植物的果實(shí)，原產(chǎn)我國(guó)廣西、廣東、江西等省的熱帶、亞熱帶山區(qū)，是衛(wèi)生部首批公布的藥食兩用的名貴中藥材，富含羅漢果甜苷、多種氨基酸和維生素等［1］.常飲羅漢果茶，可預(yù)防多種疾病，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)證明，羅漢果對(duì)支氣管炎、高血壓等疾病有顯著療效，還能起到防治冠心病、血管硬化、肥胖癥的作用.目前，廣西擁有大面積的羅漢果種植基地，羅漢果也是當(dāng)?shù)剞r(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)收入的主要來源.

土壤鹽堿化是影響全球農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)、發(fā)展和生態(tài)環(huán)境的重大問題，也是影響我國(guó)廣西地區(qū)農(nóng)林生產(chǎn)的主要因素之一，同時(shí)灌溉農(nóng)業(yè)的發(fā)展和化肥使用不當(dāng)?shù)仍蛟斐傻拇紊}漬土壤面積擴(kuò)大，也嚴(yán)重限制了廣西地區(qū)羅漢果種植產(chǎn)業(yè)的發(fā)展.鹽脅迫會(huì)抑制植物生長(zhǎng)，使農(nóng)作物產(chǎn)量受到不同程度的影響.因此，提高植物的抗鹽性，減少鹽脅迫對(duì)于農(nóng)作物的影響是人們普遍關(guān)注的話題.鈣是植物所必需的營(yíng)養(yǎng)元素，對(duì)維持細(xì)胞膜透性、離子運(yùn)輸、信號(hào)傳導(dǎo)、調(diào)控酶活性等有重要作用，研究［2-5］發(fā)現(xiàn)Ca2＋參與多種逆境脅迫過程，如鹽脅迫、高溫脅迫、低溫脅迫、氧脅迫等，可提高植物對(duì)逆境的適應(yīng)能力.當(dāng)植物受到外界脅迫時(shí)，細(xì)胞內(nèi)Ca2＋濃度升高，可與鈣調(diào)蛋白質(zhì)結(jié)合成激活態(tài)復(fù)合體，激活基因表達(dá)，啟動(dòng)一系列反應(yīng)使植物適應(yīng)脅迫環(huán)境.華智銳等［6］研究發(fā)現(xiàn)施加適量濃度的外源鈣能顯著抑制鹽脅迫下黃芩幼苗MDA的積累；周紅菊［7］發(fā)現(xiàn)鹽脅迫能明顯降解葉綠素含量，外源鈣能有效緩解鹽脅迫對(duì)玉米幼苗葉綠素含量的影響；嚴(yán)蓓等［8］指出外源噴施Ca2＋可提高黃瓜幼苗的鹽脅迫耐性；楊莎等［9］在研究外源鈣對(duì)鹽脅迫下花生幼苗的影響時(shí)，發(fā)現(xiàn)施加外源鈣可以誘導(dǎo)花生幼苗抗氧化酶系統(tǒng)（CAT、POD和SOD）酶活性升高，祛除因鹽脅迫造成積累的活性氧，降低活性氧對(duì)花生幼苗的破壞程度.然而，鈣對(duì)植物鹽脅迫的緩解效果因鈣鹽種類、濃度、不同植物種類等而不同，目前外源鈣能否緩解鹽脅迫對(duì)羅漢果幼苗的傷害及其適宜濃度，還未見相關(guān)報(bào)道.因此，本文擬研究不同濃度的外源鈣對(duì)鹽脅迫下羅漢果幼苗生理特性的影響，以期為羅漢果幼苗的鹽漬栽培及品質(zhì)提高提供參考.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料本實(shí)驗(yàn)于2019年4月15日上午9：00選用長(zhǎng)勢(shì)一致，株高為30 cm左右的一年生羅漢果幼苗，栽培在內(nèi)徑為20 cm，高為15 cm的普通花盆內(nèi)，置于玉林師范學(xué)院農(nóng)學(xué)院玻璃溫室大棚，棚內(nèi)晝夜溫度分別為28和20℃，白天光強(qiáng)為1 200 μmol／（m2·s），相對(duì)濕度保持在60%±2.5%.培養(yǎng)土選用V（園土）∶V（基質(zhì)）∶V（有機(jī)肥）＝1∶1∶1比例混合混勻，盆內(nèi)土高12 cm，每個(gè)盆種植羅漢果幼苗1株，種植后土面上散上一層木屑起保水作用，在每株幼苗旁插上長(zhǎng)120 cm的竹條，供幼苗攀爬.緩苗3周后開始鹽脅迫試驗(yàn).為保證幼苗健康生長(zhǎng)，緩苗期土壤含水量為（25.4±1.23）%.

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)前期實(shí)驗(yàn)研究表明，羅漢果耐鹽性較弱，120 mmol／L的NaCl濃度會(huì)對(duì)羅漢果幼苗造成顯著影響，大于120 mmol／L的NaCl濃度甚至?xí)斐捎酌缢劳觯驹囼?yàn)選擇臨界NaCl濃度120 mmol／L進(jìn)行.試驗(yàn)于2019年5月11日在廣西玉林師范學(xué)院玻璃溫室大棚中進(jìn)行，本試驗(yàn)采用完全隨機(jī)試驗(yàn)，CaCl2濃度梯度分別為0、2、6、10、14和18 mmol／L（T1、T2、T3、T4、T5、T6），其中T1～T6為鹽脅迫（NaCl）組，且鹽脅迫濃度為120 mmol／L，以自來水處理為對(duì)照（CK），共計(jì)設(shè)置7個(gè)處理.脅迫處理14 d后，選擇長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗，取植株中部生長(zhǎng)一致的葉片，每個(gè)處理隨機(jī)選取3株進(jìn)行重復(fù)測(cè)定.具體試驗(yàn)處理見表1.

表1 試驗(yàn)處理設(shè)計(jì)Tab.1 Test processing design

1.3 實(shí)驗(yàn)方法參照葉寶興［10］的測(cè)定方法，丙二醛（MDA）含量的測(cè)定采用硫代巴比妥酸（TBA）顯色法.參照胡炳義等［11］的測(cè)定方法，可溶性蛋白含量的測(cè)定采用紫外吸收法測(cè)定.參照張志良［12］的方法，葉綠素（Chl）含量的測(cè)定采用丙酮提取法；脯氨酸含量采用磺基水楊酸法測(cè)定；過氧化氫酶（CAT）活性的測(cè)定，采用紫外吸收法；過氧化物酶（POD）活性的測(cè)定，采用愈創(chuàng)木酚法；超氧化物歧化酶（SOD）活性的測(cè)定，采用用氮藍(lán)四唑（NBT）光還原法.

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析采用Excel 2007進(jìn)行圖表制作，運(yùn)用統(tǒng)計(jì)分析軟件SPSS 17.0對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，以P＜0.05為顯著性標(biāo)準(zhǔn).采用隸屬函數(shù)值評(píng)價(jià)施加外源鈣對(duì)羅漢果幼苗耐鹽性的影響，若所測(cè)指標(biāo)與羅漢果幼苗耐鹽性呈正向關(guān)系，則隸屬函數(shù)值計(jì)算公式為

若某一指標(biāo)與鹽脅迫耐性呈反向關(guān)系，可通過反隸屬函數(shù)計(jì)算其隸屬函數(shù)值

其中，U為某一處理下的某一指標(biāo)的隸屬值，X為某一處理生理生化指標(biāo)參數(shù)的測(cè)定值，Xmin為該指標(biāo)測(cè)定值中的最小值，Xmax為測(cè)定值中的最大值［13］.

2 結(jié)果與分析

2.1 CaCl 2對(duì)鹽脅迫下羅漢果幼苗MDA含量的影響MDA是植物細(xì)胞膜質(zhì)過氧化的產(chǎn)物之一，MDA含量不僅可以反映出組織內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度，還能間接反映植物細(xì)胞受損傷的程度［14］，在一定鹽脅迫范圍內(nèi)可以作為鑒定植物耐鹽性的生理指標(biāo)［15］.由圖1可知，濃度為120 mmol／L的鹽脅迫下，羅漢果幼苗MDA含量顯著升高（P＜0.05），施入不同濃度的外源Ca2＋均能顯著降低羅漢果幼苗MDA的含量（P＜0.05），且隨著外源鈣濃度的提高，羅漢果幼苗MDA含量先降低后升高，當(dāng)Ca2＋濃度為6 mmol／L時(shí)，MDA含量最低，與T1相比羅漢果幼苗MDA含量下降了45.53%，但仍顯著高于CK（P＜0.05）；當(dāng)外源Ca2＋濃度大于6 mmol／L時(shí)，羅漢果幼苗丙二醛含量顯著增加，但仍小于T1中MDA的含量，說明不同濃度的外源鈣能夠緩解120 mmol／L濃度的鹽脅迫對(duì)羅漢果幼苗的傷害，但存在一定差異.

圖1 不同濃度CaCl 2對(duì)鹽脅迫下羅漢果幼苗MDA含量的影響Fig.1 Effect of CaCl 2 concentration on malondialdehyde content of siraitia grosvenorii seedlings undersalt stress

2.2 CaCl2對(duì)鹽脅迫下羅漢果幼苗可溶性蛋白的影響由圖2可知，當(dāng)受到鹽脅迫時(shí)，羅漢果幼苗葉片可溶性蛋白含量顯著增加（P＜0.05）.

圖2 不同濃度CaCl 2對(duì)鹽脅迫下羅漢果幼苗可溶性蛋白含量的影響Fig.2 Effect of CaCl 2 concentration on soluble protein content of Siraitia grosvenorii seedlings under salt stress

不同濃度的外源Ca2＋均可增加葉片可溶性蛋白含量，但增幅不同.隨著外源Ca2＋濃度的增加，可溶性蛋白呈現(xiàn)出先增加后減小的趨勢(shì).

當(dāng)Ca2＋濃度在6 mmol／L時(shí)，可溶性蛋白含量達(dá)到最大值（P＜0.05），與T1相比增幅達(dá)76.68%；當(dāng)Ca2＋濃度大于6 mmol／L時(shí)，可溶性蛋白含量減小，但仍顯著高于T1可溶性蛋白含量（P＜0.05），這可能是由于羅漢果幼苗在受到鹽脅迫時(shí)，為適應(yīng)生長(zhǎng)環(huán)境而在體內(nèi)合成了某種蛋白酶，以應(yīng)對(duì)逆境下的不良影響.一定濃度的外源Ca2＋可以有效提高對(duì)鹽脅迫下的羅漢果幼苗可溶性蛋白含量，降低滲透勢(shì)，增大膨壓，提高羅漢果幼苗抵御外界鹽脅迫的能力，但當(dāng)外源Ca2＋濃度大于10 mmol／L時(shí)，可溶性蛋白含量顯著降低（P＜0.05），這可能是由于植物組織細(xì)胞內(nèi)鈣離子累積量過高，打破了細(xì)胞內(nèi)的滲透調(diào)劑物質(zhì)的平衡狀態(tài)，從而抑制可溶性蛋白增加，說明不同植物種類對(duì)外源鈣耐受力與生理反應(yīng)不相同.濃度為6～10 mmol／L的CaCl2能顯著增加濃度為120 mmol／L的鹽脅迫下羅漢果幼苗可溶性蛋白的含量.

華智銳等［16］研究外源Ca2＋對(duì)鹽脅迫下商洛丹參的影響，發(fā)現(xiàn)一定濃度的外源Ca2＋會(huì)使鹽脅迫下丹參幼苗可溶性蛋白含量增加，這與本文研究結(jié)果一致.

2.3 CaCl 2對(duì)鹽脅迫下羅漢果幼苗脯氨酸含量的影響脯氨酸作為重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，在維持植物體原生質(zhì)穩(wěn)定性上起著至關(guān)重要的作用.脯氨酸還可通過改善一些抗氧化酶活性、光合活性和植物生長(zhǎng)，來增強(qiáng)植物的耐鹽性［17-18］.如圖3所示，羅漢果幼苗在120 mmol／L鹽脅迫下，脯氨酸含量顯著增加（P＜0.05）.

圖3 不同濃度CaCl 2對(duì)鹽脅迫下羅漢果幼苗脯氨酸含量的影響Fig.3 Effect of CaCl 2 concentration on proline content of Siraitia grosvenorii seedlings under salt stress

施入外源Ca2＋后，羅漢果幼苗脯氨酸含量隨著Ca2＋濃度升高呈先升后降的趨勢(shì)，且均顯著高于CK和T1（P＜0.05）.外源Ca2＋濃度為6 mmol／L時(shí)，脯氨酸含量達(dá)到最大值，與T1相比增加了148.69%（P＜0.05）；外源Ca2＋濃度大于6 mmol／L時(shí)，羅漢果幼苗脯氨酸含量下降，與T1相比分別增加了124.92%、117.29%和112.67%.可見不同濃度的外源鈣能夠提高羅漢果幼苗脯氨酸的含量.

2.4 CaCl 2對(duì)鹽脅迫下羅漢果幼苗葉綠素含量的影響葉片是植物進(jìn)行光合作用的主要器官，葉綠素含量是影響植物光合作用的重要因素，葉綠素含量的高低在一定程度上反映植物進(jìn)行光合作用的水平［19］.

由圖4可以看出，120 mmol／L鹽脅迫處理下，羅漢果幼苗Chl a、Chl b含量均顯著降低（P＜0.05）；隨著外源Ca2＋濃度的增加，Chl a、Chl b含量呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢(shì)；當(dāng)外源Ca2＋濃度為6 mmol／L，Chl a、Chl b含量達(dá)到最大值，與T1相比分別增加了73.71%和31.36%；當(dāng)外源Ca2＋濃度大于6 mmol／L時(shí)，Chl a、Chl b含量逐漸減少，T6處理下，羅漢果幼苗Chl a、Chl b含量最少.同時(shí)，120 mmol／L鹽脅迫處理后羅漢果幼苗Chl a＋b含量和Chl a／b均顯著低于CK（P＜0.05）.隨外源Ca2＋濃度增加羅漢果幼苗Chl a＋b含量和Chl a／b呈先升高后降低，經(jīng)方差分析T1～T4處理，其中T3處理后，羅漢果幼苗Chl a＋b含量和Chl a／b甚至超過對(duì)照CK，分別增加了6.42%和20.29%.T6處理下羅漢果幼苗Chl a＋b含量和Chl a／b均達(dá)到最低.

圖4 不同濃度CaCl 2對(duì)鹽脅迫下羅漢果幼苗葉綠素含量的影響Fig.4 Effect of CaCl 2 concentration on chlorophyll content of Siraitia grosvenorii seedlings under salt stress

2.5 CaCl 2對(duì)鹽脅迫下羅漢果幼苗葉片CAT、SOD和POD活性的影響由圖5可知，與CK相比，120 mmol／L鹽脅迫處理下，羅漢果幼苗POD、CAT活性顯著增強(qiáng)，SOD活性顯著降低（P＜0.05）.外源施加不同濃度Ca2＋，均能提高3種保護(hù)酶活性.隨著外源Ca2＋濃度的增加，SOD、POD、CAT活性均先增強(qiáng)后減弱；不同濃度的外源Ca2＋均能顯著提高120 mmol／L鹽脅迫下羅漢果幼苗SOD和CAT活性；T2、T3處理下，羅漢果幼苗SOD、POD和CAT活性均隨著Ca2＋濃度升高而升高，當(dāng)Ca2＋濃度為6 mmol／L時(shí)，羅漢果幼苗體內(nèi)SOD、POD和CAT活性達(dá)到最大，與T1相比增加顯著（P＜0.05），分別增加83.53%、21.11%和78.81%；當(dāng)Ca2＋大于6 mmol／L時(shí)，羅漢果幼苗SOD、POD活性顯著降低（P＜0.05），CAT活性降低.T6處理下，羅漢果幼苗SOD、POD和CAT活性最低.

圖5 不同濃度CaCl 2對(duì)鹽脅迫下羅漢果幼苗抗氧化酶活性的影響Fig.5 Effect of CaCl 2concentration on SOD，POD，CAT activity of Siraitia grosvenorii seedlings under salt stress

2.6 不同濃度外源鈣對(duì)鹽脅迫下羅漢果幼苗各指標(biāo)的隸屬度分析隸屬函數(shù)值可分為4個(gè)等級(jí)，其等級(jí)代表植物適應(yīng)環(huán)境的不同程度：不抗型（隸屬值 ＜0.2）、弱抗型（0.2≤隸屬值≤0.4）、中抗型（0.4≤隸屬值≤0.6）、高抗型（0.6≤隸屬值≤1）［20］.將外源鈣對(duì)鹽脅迫下羅漢果幼苗測(cè)定的10個(gè)指標(biāo)生理指標(biāo)參數(shù)的隸屬函數(shù)計(jì)算加權(quán)平均值，綜合評(píng)價(jià)外源鈣對(duì)羅漢果耐鹽性的影響，如表2所示.在CK～T6處理下，不同濃度CaCl2處理羅漢果幼苗的耐鹽性綜合排名

表2 不同濃度CaCl 2對(duì)鹽脅迫下羅漢果幼苗各指標(biāo)的隸屬度分析Tab.2 Analysis of the subordinate degree of different concentrations of CaCl 2 on the indexes of Siraitia grosvenorii seedlings under salt stress

可見T1和T6處理屬于弱抗型，T2、T5屬于中抗型，CK、T3和T4屬于高抗型.因此，緩解羅漢果幼苗鹽脅迫最好的外源鈣濃度為6 mmol／L.

3 結(jié)論與討論

植物遭到鹽脅迫時(shí)，活性氧代謝平衡被破壞，活性氧積累，自由基增加，生理指標(biāo)發(fā)生不同程度的變化.文獻(xiàn)［21］研究表明，Ca2＋是植物生長(zhǎng)所必須的大量元素，是偶聯(lián)胞外信號(hào)和胞內(nèi)生理反應(yīng)的第二信使，在調(diào)節(jié)植物細(xì)胞對(duì)逆境適應(yīng)性過程中發(fā)揮著重要作用.Ca2＋可增加質(zhì)膜的穩(wěn)定性和鈣信號(hào)系統(tǒng)的正常發(fā)生和傳遞，以維持細(xì)胞內(nèi)離子平衡，降低質(zhì)膜透性，組織胞內(nèi)鉀離子的外滲和鈉離子的進(jìn)入.MDA作為膜脂過氧化的主要產(chǎn)物，直接關(guān)系到植物細(xì)胞膜受損程度.本試驗(yàn)中鹽脅迫處理下羅漢果幼苗葉片MDA含量升高，表明鹽脅迫加強(qiáng)了植物細(xì)胞膜脂過氧化程度；施入不同濃度的外源鈣后，MDA含量呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)，說明一定濃度的外源Ca2＋達(dá)到6 mmol／L時(shí)能夠有效緩解鹽脅迫對(duì)羅漢果幼苗的傷害，利于植物器官壽命的延長(zhǎng)［22］.但當(dāng)外源鈣濃度過高時(shí)，這種緩解作用就被抑制，這與鄭秀芳等［23］對(duì)馬鈴薯（Solanum tuberosumL.）的研究相一致.

可溶性蛋白、脯氨酸是植物體內(nèi)重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，這些物質(zhì)含量的積累有利于植物耐鹽性提高［22］.鹽脅迫下，羅漢果幼苗通過提高自身滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)緩解鹽脅迫帶來的傷害，加入外源Ca2＋后受顯著增強(qiáng)了羅漢果幼苗可溶性蛋白及脯氨酸含量.當(dāng)外源Ca2＋濃度為6 mmol／L時(shí)，羅漢果幼苗可溶性蛋白和脯氨酸含量最高；說明適宜濃度的外源Ca2＋可以有效提高羅漢果幼苗可溶性蛋白及脯氨酸含量，羅漢果幼苗通過提高自身滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)抵御鹽脅迫帶來的傷害.

葉綠素含量在一定程度上反映植物同化物質(zhì)能力的強(qiáng)弱［24］.鹽脅迫對(duì)羅漢果幼苗葉綠素含量影響顯著，鹽脅迫下，羅漢果幼苗Chl a、Chl b、Chl a＋b含量和Chl a／b均顯著下降，這可能是由于鹽脅迫下葉綠體中的光系統(tǒng)Ⅱ（PSⅡ）的光能捕獲和用于電子傳遞的量子產(chǎn)額，從而影響了植物的光合性能［25］.導(dǎo)致鹽脅迫下葉綠素含量會(huì)降低，施入不同濃度外源Ca2＋后，羅漢果幼苗Chl a、Chl b、Chl a＋b含量和Chl a／b先增加后降低.當(dāng)外源Ca2＋為6 mmol／L時(shí)，Chl a、Chl b、Chl a＋b含量和Chl a／b均達(dá)到最大值，這可能是因?yàn)橐欢舛鹊耐庠碈a2＋能顯著增強(qiáng)植物葉片抗氧化酶活性，清除活性氧，大大緩解葉綠素含量的分解，增強(qiáng)植物葉片對(duì)鹽脅迫的適應(yīng)性，提高植物葉片利用光的能力，這與劉麗等［26］研究結(jié)果一致.

鹽脅迫下，SOD、POD、CAT作為植物抗氧化物保護(hù)酶，能夠清楚自身多余的活性氧及自由基［27］.本文中羅漢果幼苗在120 mmol／L鹽脅迫時(shí)，SOD活性減弱，POD、CAT活性增強(qiáng)，加入不同濃度的外源Ca2＋后，SOD和CAT活性均顯著增強(qiáng).POD除在T2處理后活性降低外，其余活性均顯著增加，說明外源Ca2＋能有效提高羅漢果幼苗抗氧化酶活性，這與劉藝平等［28］的研究結(jié)果一致.當(dāng)外源Ca2＋達(dá)到6 mmol／L時(shí)，SOD、POD、CAT活性均達(dá)到最高，說明濃度為6 mmol／L的外源Ca2＋能顯著提高鹽脅迫下羅漢果幼苗抗氧化酶活性.

經(jīng)隸屬函數(shù)綜合分析表明，不同濃度CaCl2處理羅漢果幼苗的耐鹽性綜合排名為

可見，T1、T6處理屬于弱抗型，T5、T2屬于中抗型，T4、CK和T3屬于高抗型.因此，外源鈣濃度為6～10 mmol／L能顯著緩解羅漢果幼苗鹽脅迫，濃度為6 mmol／L效果最佳.