生物基質(zhì)中雌激素的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜定量分析方法研究進展

范茹婷， 肖華明， 察冬梅， 王 獻

(中南民族大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，分析化學(xué)國家民委重點實驗室，湖北武漢 430074)

1 前言

在生物基質(zhì)中總雌激素被定義為母體雌激素及其代謝產(chǎn)物的總和。母體雌激素包括雌酮和雌二醇，總代謝物是母體雌激素在2-，4-和16-途徑的代謝物的總和[1,2]。Xu等[3]對這些代謝物的代謝途徑進行了研究。人體內(nèi)雌激素的濃度水平與機體功能和疾病有著密切的關(guān)系。當(dāng)雌激素的代謝趨向于因氧化而變得不平衡時，就會形成大量的加合物，大大增加患癌癥的風(fēng)險[4]，可能引起的疾病有肝癌(肝纖維化)[5]、先兆子癇[1]、乳腺癌[6,7]等。在疾病的診斷和預(yù)防以及癌癥流行病學(xué)研究中，需要一種高度靈和高特異性的方法來確定雌激素的含量。目前雌激素的檢測涵蓋不同類型的生物樣本，如血液、尿液、乳腺癌細胞[8]、前列腺[9]、皮膚[10]、和乳房，以及腎上腺、睪丸、肝臟、卵巢和子宮等等[11,12]。為了研究人類生殖發(fā)育和疾病中雌激素的生物效應(yīng)，還會以小鼠、猴子為模型[1]來研究雌激素的代謝途徑。

生物組織和體液中的雌激素濃度通常較低，且濃度范圍跨度大[13]。青春期前的兒童、青少年，絕經(jīng)前和絕經(jīng)后婦女以及孕婦體內(nèi)的雌二醇濃度范圍的跨度高達兩個數(shù)量級。因此，在如此寬的濃度范圍內(nèi)對雌激素進行準確定量是一項困難的工作[14]。此外，同分異構(gòu)體的存在(如雌激素的代謝物17α-雌二醇和17β-雌二醇)，使得雌激素檢測更加困難[15,16]。目前，生物樣本雌激素定量檢測的的主要方法有酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)[17 - 19]、放射免疫法(RIA)[20 - 22]、氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)[23]及液相色譜-質(zhì)譜法(LC-MS)[24]。RIA和ELISA法等免疫測定已在臨床和環(huán)境實驗室中廣泛使用[25]。但是RIA法中的放射性元素需要嚴格控制，并且需要繁瑣耗時的操作過程[26]。ELISA法選擇性差，易與其他雌激素或試劑盒試劑發(fā)生交叉反應(yīng)[27]。GC-MS法檢測時間較長，且熱穩(wěn)定性差的化合物容易發(fā)生復(fù)雜的源內(nèi)裂解，不利于GC-MS的精確定量[23]。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)能夠?qū)崿F(xiàn)高通量快速檢測，且假陽性率低，適用于生物基質(zhì)中痕量類固醇化合物的分析，成為目前的主要檢測方法之一[24]。

雌激素的生物學(xué)功能研究及其代謝過程與疾病相關(guān)性信息的獲取，需要開發(fā)出對雌激素精確定量的分析方法。本文針對LC-MS/MS聯(lián)用技術(shù)檢測不同生物基質(zhì)中雌激素的研究進展，對樣品前處理、衍生化方法、色譜-質(zhì)譜的儀器與方法，以及不同類型的生物基質(zhì)中雌激素的檢測結(jié)果進行了綜述和討論，并對雌激素檢測領(lǐng)域未來需要解決的問題進行了展望。

2 前處理方式

提取不同生物基質(zhì)中的雌激素，最常用的方法是液-液萃取(LLE)和固相萃取(SPE)。雌激素分析流程如圖1所示，主要包括樣品的提取、衍生化及LC-MS/MS檢測三部分。

圖1 雌激素LC-MS/MS分析流程圖Fig.1 Flow chart of the LC-MS/MS analysis of estrogens

2.1 液-液萃取

LIE技術(shù)采用兩種極性不同并且互不相溶的溶劑來提取親脂性分析物，然后可以對其進行有效干燥并重構(gòu)，以注入到LC-MS/MS系統(tǒng)中進行檢測。LLE在蛋白質(zhì)沉淀方面也提供了重大改進，可去除脂質(zhì)部分(包括磷脂)[27]。已有報道用乙酸乙酯[28]、甲基叔丁基醚(Methyltert-Butyl Ether,MTBE)[29,30]、氯丁烷[31]等有機溶劑從生物基質(zhì)中提取雌激素。在使用化學(xué)衍生化方法時，通常使用LLE進行雌激素提取，通過優(yōu)化比較不同的提取溶劑發(fā)現(xiàn)使用乙酸乙酯回收率更高。而使用MTBE時，會出現(xiàn)更高的基質(zhì)效應(yīng)[28]。但是LLE需要使用大量有機溶劑，對人體健康和環(huán)境都會造成不利的影響[32]。

2.2 固相萃取

SPE與LC-MS/MS結(jié)合使用對于半自動化樣品分析是一種非常有前景的技術(shù)。在線SPE的優(yōu)勢包括分析時間更短、濃縮富集增敏和減少樣本污染等，使得方法的靈敏度進一步提高[33]。離線的SPE小柱通常涉及一系列固定相材料，且臨床應(yīng)用中都是可商用的C18反相柱或離子交換柱。Han等[34]計算了六種雌激素的logKOW范圍為2.94～4.52,疏水性中等，因此使用硅膠作為填料進行分散固相萃取時，能夠比C18小柱更好地將中等極性的雌激素成分進行保留。親脂-親水Oasis?HLB吸附相，對于類固醇類化合物具有極好的保留效果[35]。Zhao等[36]報道了一種僅使用一個SPE步驟測定尿液中游離雌激素的方法，該方法將樣品加載到Oasis HLB?(親水-親脂)柱上后，用乙酸乙酯洗脫游離的雌激素。Liu等[37]利用PRiME HLB固相萃取小柱可以有效地將牛乳和乳粉中的脂肪等干擾成分去除，在牛乳基質(zhì)中的加標回收在87.7%～110.8%以內(nèi)。對于血清、血漿等復(fù)雜基質(zhì)，使用市售Oasis MCX?離子交換柱，通過陽離子交換作用可在洗脫雌激素之前，將血漿中的離子抑制作用降至最低，從而有效去除血漿樣品中的磷脂使樣品得到凈化[38]。Beinhauer等[39]通過將帶電本體衍生化和基于弱陽離子交換(WCX)RAM捕集柱相結(jié)合，進行自動在線捕集和洗脫樣品，簡化的流程僅需100 μL血清，定量限可以達到3 pg/mL，適用于雌激素含量較低的人群，如年長的男性、兒童和絕經(jīng)后的女性。磁性固相萃取(MSPE)技術(shù)也開始應(yīng)用于檢測生物基質(zhì)中的雌激素。Xiong等[40]開發(fā)了一種MSPE方法，采用具有雙十八烷基和2-氨基乙基-3-氨基丙基(C18/NH2-Fe3O4@mSiO2)官能團的磁性介孔SiO2核-殼納米粒子，合成磁性納米顆粒作為MSPE的吸附劑。與傳統(tǒng)的SPE相比，其MSPE操作更簡單，不需要特殊的儀器以及復(fù)雜的表面修飾。該方法應(yīng)用于檢測市售豬里脊肉和雞胸肉樣品中的十一種雌激素，檢出限為0.02±3.00 μg·kg-1。在復(fù)雜食品樣品中的痕量化合物進行分析具有良好的可行性和前景。

3 化學(xué)衍生-LC-MS與直接LC-MS雌激素檢測方法對比

3.1 化學(xué)衍生與LC-MS聯(lián)用法

化學(xué)衍生化是一種常見的樣品前處理手段，通過與衍生試劑的反應(yīng)來修飾分析物上的官能團，以增強分析物的紫外[41]、熒光[42]或質(zhì)譜響應(yīng)[43]。在LC-MS分析中，衍生試劑可以通過改變目標化合物的活性基團，例如胺基、羧基、羥基、硫醇基等來改變目標化合物的色譜保留時間[44]。此外，還可以提高改性分析物的電離效率，從而有效提高其檢測靈敏度。類固醇雌激素和酚類異雌激素屬于弱酸，與其他極性較大的化學(xué)藥品相比，它們在電噴霧電離-質(zhì)譜(ESI-MS)和大氣壓化學(xué)電離-質(zhì)譜(APCI-MS)上的電離效率不高[45]。通過化學(xué)衍生可以在類固醇雌激素和酚類異雌激素上增加部分親脂性基團，從而提高電離效率，并增強質(zhì)譜響應(yīng)信號[46,47]。

丹磺酰氯(Dansyl Chloride,DNS)是使用率最高的衍生化試劑之一，常用于雌激素的衍生[28,48 - 50]。該試劑可以與酚羥基和氨基官能團靶向結(jié)合，使化合物可用于熒光、紫外和質(zhì)譜分析檢測[51,52]。由于該試劑的二甲氨基基團具有強質(zhì)子親和力，丹磺酰氯的衍生物表現(xiàn)出良好的質(zhì)譜響應(yīng)信號。丹磺酰氯的質(zhì)譜增敏作用可輔助發(fā)現(xiàn)并定量人體內(nèi)潛在的雌激素代謝產(chǎn)物[53]。Van等[54]利用丹磺酰氯衍生一次性檢測出27種雌激素的代謝產(chǎn)物。丹磺酰氯與酚羥基的特異性反應(yīng)，還可以平行測定人體內(nèi)多種類固醇激素，實現(xiàn)針對一種疾病的類固醇代謝通路的高通量檢測[55]。盡管采用丹磺酰氯和吡啶-3-磺酰氯(Pyridine-3-sulfonyl Chloride,PS)進行酚羥基的衍生化都是基于親核取代反應(yīng)，但是吡啶-3-磺酰氯中的吡啶基團的有著較小尺寸，而小位阻的單-PS衍生物會增加雙酚的第二羥基部分的衍生化速率。引入帶堿性N的PS官能團可將分子預(yù)測的pKa增加至2.5左右，從而促進化合物在水溶液中的電離[56]，1-甲基咪唑-2-磺酰氯(1-Methylimidazole-2-sulfonyl Chloride,IS)[43]與丹磺酰氯反應(yīng)原理相類似，但是咪唑磺酰基比丹磺酰基部分小且親脂性較低，因此所有IS衍生產(chǎn)物的分析時間短并且所需的溶劑更少。Li等[30]檢測時使用orbitrap MS對精確質(zhì)量的母離子進行定量，因此無需再處理碎片離子，使用1,2-二甲基咪唑-5-磺酰氯(1,2-Dimethylimidazole-5-sulfonyl Chloride,DMIS)則可以在很寬線性范圍內(nèi)監(jiān)測雌二醇特異性定性離子通道。與另一種已知的具有分析物特異性裂解的衍生試劑(吡啶-3-磺酰氯)相比，DMIS具有明顯的靈敏度優(yōu)勢。羥胺是可以同時對雌激素、雄激素、皮質(zhì)類固醇和孕酮的進行衍生[57]。我們前期工作采用了一種羥胺衍生化技術(shù)與LC-MS/MS檢測技術(shù)相結(jié)合的方法，可提高用于質(zhì)譜的電離效率，并同時定量了十種類固醇激素，包括雌激素，雄激素，孕酮和皮質(zhì)類固醇四類類固醇[58]。目前衍生化技術(shù)可以很好地提高雌激素的檢測靈敏度，但是定量檢測特異性差，用于定量的子離子碎片來源于衍生化試劑并非雌激素[36]。對復(fù)雜基質(zhì)樣品進行非特異性的衍生化也增加了共流出的雜質(zhì)干擾，即很強的基質(zhì)效應(yīng)，因此尋找特異性和靈敏度兼具的衍生試劑也是當(dāng)前研究的難點之一。

3.2 直接LC-MS法

化學(xué)衍生化不是改善靈敏度的唯一解決方案。對于不衍生的雌激素通常使用負離子模式進行測定，Yi等[59]使用0.05%氫氧化銨，在流動相中添加氫氧化銨可以使雌二醇適當(dāng)電離，并使信號最大化，但是在堿性條件下對色譜柱有一定的腐蝕性。氟化銨可在負離子模式下為雌酮和雌二醇提供更好的信號，通常將氟化銨添加到與電噴霧負電離模式結(jié)合使用的流動相中以增強未衍生雌激素的信號[9,60,61]。Julianne等[62]在LC的緩沖液中使用0.2 mmol/L氟化銨在負離子下促進雌二醇的電離。通過這種方法提高了雌二醇檢測的靈敏度，足以檢測男性、絕經(jīng)前和絕經(jīng)后婦女血清中的雌二醇，定量限為2.61 pmol/L(0.71 pg/mL)。

4 色譜-質(zhì)譜雌激素分析檢測儀器

4.1 色譜

雌激素的檢測難點主要在于靈敏度低和特異性差。17β-雌二醇是雌二醇的活性立體異構(gòu)體，而其差向異構(gòu)體17α-雌二醇則沒有雌激素活性。為了選擇性地定量17β-雌二醇，則需要對這樣的異構(gòu)體進行色譜分離。Yi等[59]使用納升LC分離雌激素，流速僅為35 μL/min，LC-MS/MS總檢測時長為3.5 min，最終在無衍生化的條件下測血清樣品的定量限為3.0 pg/mL。二維色譜可以通過減少不必要的LC洗脫液，確保樣品在線純化并減小對質(zhì)譜檢測器的損傷[61,63]。Hemamalini等[14]采用二維色譜對雌激素進行檢測，在11 min內(nèi)進行在線純化和分離，雌二醇的定量限低至0.3 pg/mL。

4.2 離子源

ESI通過溶劑蒸發(fā)產(chǎn)生離子，適用于中等至高極性的分析物[64,65]。在APCI中，霧化的樣品通過電暈放電電離，從而提供較強的電離，適用于難以在溶液中形成離子的化合物，因此更適用于這些高脂溶性的類固醇[66,67]。盡管APCI可以提高非極性化合物的電離效率，但很少用于未衍生化的類固醇雌激素[68]。Higashi等[41]利用4-硝基苯甲酰氯在衍生化后引入硝基，使用ECAPCI-MS進行檢測，比未衍生化的檢測響應(yīng)提高了8～23倍，血清樣本消耗量僅為10 μL。Lien等[69]發(fā)現(xiàn)與其它電離源包括APCI相比，ESI對于丹磺酰氯衍生的雌激素化合物的信號強度更高。大氣壓光電離(APPI)是新興的電離源，能夠使非極性化合物電離，并且不易受到基質(zhì)效應(yīng)的影響。衍生物在APPI-MS和APCI-MS中幾乎只產(chǎn)生[M+H]+離子，且APPI-MS中衍生物的離子強度低于APCI-MS中的離子強度，但由于APPI-MS中的背景噪聲較低，因此可獲得更低的檢出限[45]。

4.3 質(zhì)量分析器

靜電場軌道阱(Orbitrap)與三重四極桿相比，在檢測1-甲基咪唑-2-磺酰基雌激素衍生物方面特異性有了提高[43]，雌激素衍生物用于定量的碎片離子大多數(shù)是衍生試劑上的非特異性的碎片離子，Orbitrap MS采用更精確的母離子進行分析物定量，因此無需處理碎片離子，該方法采用選擇離子模式監(jiān)測18種類固醇，檢出限可達到0.02～12 pg/mL。Darville等[70]在此基礎(chǔ)上進行了方法優(yōu)化，使用高分辨率(HR)Orbitrap質(zhì)譜儀量化人尿中所有15種1-甲基咪唑-2-磺酰氯衍生的雌激素和雌激素代謝物，定量限在1～20 pg/mL之間。Li等[71]利用AB Sciex QTRAP系列儀器中的Analyst軟件提供的Sum Multiple Ion功能實現(xiàn)5次多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式的采集并進行加和，與未加和的結(jié)果相比靈敏度提高了3～4倍。

5 不同生物基質(zhì)中雌激素的檢測研究進展

在各種臨床樣本中，血清和血漿最為常見，而尿液，唾液等樣本由于簡單易獲取，也越來越多地應(yīng)用于臨床中。測量生物基質(zhì)中的內(nèi)源激素的難度在于其低生理濃度和復(fù)雜基質(zhì)的干擾。在尿液和血漿中，類固醇主要以葡醛酸苷、硫酸鹽或它們的混合物的形式存在，其他的大多數(shù)結(jié)合在載體蛋白(如性激素結(jié)合球蛋白或白蛋白)上，而未結(jié)合或“游離”的濃度極低。因此，很難對生物體液中游離的雌激素進行分離分析[43]。

血液樣本已經(jīng)廣泛應(yīng)用于臨床檢測，如臍帶血、母體血清中雌激素的測定已被納入產(chǎn)前出血、自閉癥或先兆流產(chǎn)的檢測中。在胎兒的血清中循環(huán)的類固醇激素的濃度比在母親的血清中濃度高得多，這就意味著可能需要建立更寬的測量范圍[72]。血清的樣本采集通常需要靜脈穿刺，這種作為侵入式的樣本采集方法，需要現(xiàn)場有接受專業(yè)培訓(xùn)的人員，并且采集到的樣本需要在冷凍條件下保存[73]，這些復(fù)雜的程序使得血液樣本的獲取增加了難度。

測量合并的24 h尿液樣本已成為研究腎上腺類固醇的重要手段[51]。血漿中僅有少量的類固醇在尿液中原樣代謝，其余通過肝臟代謝。每種類固醇都會產(chǎn)生大量肝代謝產(chǎn)物，其中大多數(shù)類固醇的代謝物含有額外的羥基并與硫酸鹽或葡糖醛酸苷部分相連，所以它們更易溶解，易于被腎臟排泄。Van等[54]設(shè)計了一種通過多步固相萃取方法，將樣品純化后，對水溶性較低的部分進行衍生化，僅用6 mL的尿液樣本就可以完成包括母體雌激素、羥基化和甲基化形式、16α-羥基雌激素途徑的代謝物、硫酸鹽和葡糖醛酸化物結(jié)合形式的雌激素的分析。

唾液通常被用作生物基質(zhì)，因為它可以非侵入式取樣并且即使在非臥床環(huán)境中也很容易收集。此外，大多數(shù)循環(huán)激素以非生物活性激素的形式與載體蛋白結(jié)合，而唾液類固醇激素的濃度與血液中游離的和未結(jié)合的激素組分密切相關(guān)，因此可輕松獲得生物活性激素組分的測量值[71]。Wei等[74]使用API 5000光譜儀與在線SPE相結(jié)合的方法，首次實現(xiàn)唾液雌二醇未衍生化的雌二醇的LC-MS/MS分析測定，僅用100 μL唾液同時鑒定和定量唾液樣品中的雌二醇和其它六種類固醇激素靈敏度為1 pg/mL。近五年不同生物基質(zhì)的檢測方法如表1所示。

表1 近五年LC-MS/MS檢測雌激素匯總

6 結(jié)語

精確定量分析生物基質(zhì)中的雌激素有助于了解生物體的代謝過程和病理學(xué)的診斷。近年來，雖然關(guān)于LC-MS聯(lián)用技術(shù)檢測雌激素的研究已經(jīng)取得了一定的進展，但是目前還存在一些制約因素：衍生化雌激素一方面取決于衍生化試劑的特性，另一方面也和離子源的離子化效率和碰撞碎裂有關(guān)。盡管衍生化技術(shù)可以極大地提高質(zhì)譜檢測的靈敏度，但是受到生物基質(zhì)中的干擾，導(dǎo)致衍生化后基質(zhì)效應(yīng)增加，以及無特異性的衍生試劑會對測量結(jié)果的準確性造成影響。選擇性和靈敏度對于質(zhì)譜的高通量分析來說依然不可兼得，分離和儀器條件仍然是類固醇檢測的制約因素。

基于目前雌激素檢測面臨的挑戰(zhàn)，生物基質(zhì)中雌激素的LC-MS/MS檢測方法有待從以下幾個方面進行改善：(1)根據(jù)不同基質(zhì)選用不同的前處理方法以減少基質(zhì)效應(yīng)。樣本量大且易獲得的如尿液、唾液等生物樣本，可以利用固相萃取的方法更好的降低背景噪聲；根據(jù)確定雌激素的參考范圍選擇衍生化或者不衍生化；(2)尋找特異性更強的衍生化試劑。目前使用的衍生化試劑自身響應(yīng)信號強，對定量目標化合物會造成干擾。因此，有必要開發(fā)能夠產(chǎn)生與雌激素結(jié)構(gòu)關(guān)聯(lián)的碎片離子的衍生化試劑；(3)進一步改進和發(fā)展質(zhì)譜檢測技術(shù)，例如，使用納升色譜，二維色譜進樣，為雌激素的檢測提供硬件支持。

隨著越來越多樣品前處理方法的出現(xiàn)，新的化學(xué)衍生試劑不斷被發(fā)現(xiàn)，LC-MS分析方法的研究與開發(fā)，LC-MS雌激素分析技術(shù)有望成為臨床病理研究和診斷領(lǐng)域的重要方法，并日益廣泛的應(yīng)用于化學(xué)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域中。