高效液相色譜法測定彩棉中棉酚旋光異構體含量

劉 俊， 李 洋， 李海濤， 曾 鮮， 姚 軍*， 袁 潔

(1.烏魯木齊海關技術中心，新疆烏魯木齊 830063；2.新疆醫科大學藥學院，新疆烏魯木齊 830011；3.天津市理化分析中心，天津 300051；4.新疆醫科大學厚博學院，新疆克拉瑪依 834000)

自然生長且帶有顏色的棉花稱為天然彩色棉，主要包括棕色和綠色兩種品系。我國新疆已成為世界最大的彩棉生產基地，占全國彩棉總量的95%，占世界彩棉總量的60%[1]。與普通白棉相比，彩棉色澤天然長成，加工過程無需印染，織物不殘留有害化學物質，因而被譽為 “人類第二健康肌膚”，其紡織品具有廣闊的市場前景。

棉酚(Gossypol)[2,3]是存在于錦葵科植物棉花的根、莖、葉和棉籽仁內的一種黃色多酚類化合物，因其結構中含有活性的醛基和羥基而具有毒性。棉酚分子結構中有一個手性軸，因而存在兩種光學異構體，即左旋棉酚((-)-棉酚)和右旋棉酚((+)-棉酚)，兩者毒性和藥理活性均不相同[4,5]，因此常常需要對其進行拆分檢測。由于棉酚的化學毒性，國家制定了棉籽油和棉粕飼料中棉酚的檢測標準[6,7]。目前對棉酚的檢測主要集中在棉籽[8,9]、棉籽油[10,11]和棉粕飼料[12,13]等方面，未有對棉花中游離棉酚對映體含量的檢測。棉花作為紡織品原料，與人體皮膚接觸，如果其棉酚含量較高，可能會對消費者的健康造成潛在的危害。因此，建立一種簡單、快速的針對棉花基質中棉酚旋光異構體的檢測方法具有重要的現實意義。

本研究選擇超聲提取法提取棉花基質中的棉酚旋光異構體，采用高效液相色譜法(HPLC)測定其含量。該方法操作簡便，準確度高，精密度好，可用于新疆彩棉中棉酚旋光異構體的檢測。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

Agilent 1260型高效液相色譜儀(美國，Agilent公司)；TB-114型電子分析天平(北京賽多利斯儀器有限公司)；YZ-250DB超聲波清洗器(上海越眾儀器設備有限公司)。

(-)-棉酚對照品(純度>98%)、(+)-棉酚對照品(純度>98%)均為課題組自制；D -(-)蘇-1-對硝基苯基-2-氨基-1,3-丙二醇(分析純)、甲醇(色譜純)、乙醇(分析純)、磷酸(分析純)均購自百靈威科技有限公司。

棉花樣品共12種，其中棕色彩棉5種，綠色彩棉4種，普通白棉3種，依次編號為1#～12#，均購置于中國彩棉集團股份有限公司。

1.2 游離棉酚旋光異構體對照品衍生物溶液的制備[14]

精密稱取(-)-棉酚和(+)-棉酚對照品各10.0 mg，置于25 mL棕色量瓶中，加入2%的D -(-)蘇-1-對硝基苯基-2-氨基-1,3-丙二醇和10%冰HAc的N,N-二甲基甲酰胺溶液20 mL，于90 ℃水浴30 min，冷卻至室溫，用N,N-二甲基甲酰胺定容至刻度，即得400 μg/mL的(-)-棉酚和(+)-棉酚衍生物混合對照品溶液。

1.3 棉花中棉酚旋光異構體供試品溶液的制備

稱取剪碎的棉花樣品1 g，置于研缽中，加入1%的HAc乙醇溶液20 mL，研磨10 min后倒入錐形瓶中，超聲10 min，抽濾，濾液氮吹至2 mL，加入2%的D -(-)蘇-1-對硝基苯基-2-氨基-1,3-丙二醇和10%冰HAc的N,N-二甲基甲酰胺溶液20 mL，置90 ℃下水浴30 min，冷卻至室溫，用N,N-二甲基甲酰胺定容至25 mL棕色容量瓶中，即得。

1.4 色譜條件

色譜柱：Agilent SB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱溫20 ℃；流動相：甲醇-2%H3PO4溶液(85∶15，V/V)。流速：1 mL/min，檢測波長為235 nm，進樣量10 μL。

2 結果與討論

2.1 提取溶劑的選擇

游離棉酚的極性較弱，本研究發現乙醇可以有效提取棉籽中的棉酚。由于游離棉酚結構中具有酚羥基，穩定性較差，實驗發現游離棉酚在酸性條件下比較穩定，因此采用1%的HAc乙醇溶液作為提取溶液，使棉酚的穩定性大大提高，能滿足后續分析測試的要求。

2.2 棉酚旋光異構體拆分方法的選擇

本方法通過手性拆分試劑與(-)-棉酚和(+)-棉酚反應，生成的(-)-棉酚和(+)-棉酚衍生物在ODS柱上可以有效分離。實驗考察了分別采用(R)-(-)-2-胺基-1-丙醇，D -(-)蘇-1-對硝基苯基-2-氨基-1,3-丙二醇和(L)-(-)-2-氨基-3-苯基-1-丙醇對(±)-棉酚進行衍生化反應，結果表明，以D -(-)蘇-1-對硝基苯基-2-氨基-1,3-丙二醇作為手性拆分試劑，在10%冰HAc的N,N-二甲基甲酰胺溶液中，90 ℃下水浴加熱30 min，衍生化反應完全。

2.3 流動相的優化

由于棉酚呈現弱酸性，需要在流動相中添加弱酸抑制其解離，分別考察了甲醇-2%甲酸溶液和甲醇-2%H3PO4溶液作為流動相時色譜峰的情況，結果顯示甲醇-2%H3PO4分離效果好。

2.4 專屬性

取質量濃度分別為16.0 μg/mL的(-)-棉酚和(+)-棉酚衍生物混合對照品溶液，及棉酚旋光異構體供試品溶液，按“1.4”色譜條件進樣分析，得圖1。由圖1可知，對照品溶液中(-)-棉酚和(+)-棉酚衍生物和棉花供試品中(-)-棉酚和(+)-棉酚衍生物保留時間分別為22.5 min和12.1 min，其他成分無干擾。

圖1 游離棉酚旋光異構體衍生物的色譜圖Fig.1 Chromatograms of derivatives of free gossypol optical isomersA.Reference substance;B.Sample.1.Derivatives of (+)-gossypol;2.Derivatives of (-)-gossypol.

2.5 方法學考察

2.5.1 工作曲線精密吸取質量濃度為400 μg/mL的(-)-棉酚和(+)-棉酚衍生物混合對照品溶液5 mL，置于25 mL棕色容量瓶中，加入N,N-二甲基甲酰胺溶液定容至刻度，經逐級稀釋得質量濃度分別為0.128、0.64、3.20、16.0、80.0 μg/mL的棉酚旋光異構體衍生物系列溶液，按“1.4”色譜條件進樣分析。以濃度(x)為橫坐標，峰面積(y)為縱坐標進行線性回歸，得(-)-棉酚衍生物回歸方程為:y=52 594x-1 761.9(r=0.9996)；(+)-棉酚衍生物回歸方程為:y=35 839x-6 610.9(r=0.9990)。結果表明(-)-棉酚衍生物和(+)-棉酚衍生物在0.128～80.0 μg/mL范圍線性關系良好。

2.5.2 精密度取3.20 μg/mL棉酚光學異構體溶液，按“1.4”色譜條件進樣分析，平行測定6次，(-)-棉酚峰面積和保留時間的相對標準偏差(RSD)分別為1.31%和1.42%，(+)-棉酚峰面積和保留時間的RSD分別為1.76%和1.63%。表明方法的精密度良好。

2.5.3 穩定性取1#棉花，按“1.3”方法制備供試品溶液，室溫下于0、2、4、8、12、24 h進樣，按“1.4”色譜條件進樣分析，不同時間下(-)-棉酚峰面積和(+)-棉酚峰面積的RSD值分別為1.78%和1.46%，保留時間的RSD值分別為1.63%和1.54%。表明樣品溶液中棉酚旋光異構體在24 h內穩定。

2.5.4 重復性試驗取1#棉花6份，按“1.3”方法制備供試品溶液，按“1.4”色譜條件進樣分析，(-)-棉酚峰面積和(+)-棉酚峰面積的RSD分別為1.94%和1.37%，保留時間的RSD分別為1.78%和1.48%。

2.5.5 回收率試驗取0.5 g的1#棉花樣品9份，每組3份，在每組中分別加入3.20 μg/mL棉酚光學異構體對照品溶液2、3、4 mL，作為棉酚光學異構體低、中、高樣品組，按“1.3”方法制備供試品溶液，按“1.4” 色譜條件進樣分析，數據如表1所示。由表1可見檢測結果的準確度較好。

表1 棉酚旋光異構體加樣回收率結果

2.6 實際樣品檢測

采用上述方法分析了新疆5種棕色彩棉、4種綠色彩棉及3種白棉中棉酚光學異構體的含量，數據如表2所示。總體來看彩棉棉花中棉酚含量比白棉低，(+)-棉酚含量比(-)-棉酚含量低，白棉中棉酚最高含量為84.5 mg/kg，遠低于棉籽中棉酚含量(1%左右)，也低于國家標準中棉籽油中棉酚的限量0.02%。另外由于棉酚屬于極性較小的化合物，難溶于水，隨汗液吸收進入人體的量非常有限，因此可以說明棉花中微量棉酚不會對消費者的健康造成影響。

表2 不同品種棉花中棉酚光學異構體含量(mg/kg，n=3)

3 結論

建立了手性拆分試劑柱前衍生化高效液相色譜法測定新疆彩棉中棉酚光學異構體的含量，該方法樣品前處理簡單，操作簡便，準確度高，精密度好。通過對9種新疆彩棉花樣品和3種白棉樣品進行棉酚含量測定，總體來看彩棉棉花中棉酚含量比白棉低，(+)-棉酚含量比(-)-棉酚含量低，白棉中棉酚最高含量為0.00845%，低于目前棉籽油中棉酚限量為0.02%。