鞣花酸分子印跡聚合物的合成及其性能研究

鄒佳美， 平欲暉， 吳麗芳， 雙若男， 毛娟玲， 謝一輝

(江西中醫藥大學藥學院，江西南昌 330004)

多酚類物質是一類具有多酚結構并具有抗氧化[1]、抑菌[2]、抑制酶活性[3]、抗癌[4]、抗病毒[5]和降血脂[6]等功效的化合物。鞣花酸(Ellagic Acid,EA)是一種天然多酚組分，是沒食子酸的二聚體形式，是一種多酚二內酯，存在于許多軟性水果、堅果和其他植物組織中，如石榴[7,8]、草莓[9,10]、核桃[11,12]。EA具有抗氧化、抗凝血、抗菌抗病毒、抑制致癌劑的代謝活性[13 - 15]，主要應用于藥品、化妝品以及保健品的添加劑[14]。傳統的從植物粗提物中純化EA的方法有重結晶法和液-液萃取法，這些方法雖然低成本、易操作，但繁瑣、低效，并伴隨著大量有機溶劑的消耗，難以得到技術上的推廣。

分子印跡技術(Molecularly Imprinting Technology,MIT)是以特定的目標化合物為模板分子，制備對該目標化合物及其結構類似物具有選擇性識別能力的聚合物技術。它具有分離效率高、化學物理性質穩定、制備簡單等優點。目前，分子印跡技術廣泛應用于環境中微量物質的分析[15]、藥物分析[16]等的研究中，在離子液體[17]、熒光探針技術[18]、電化學傳感[19]也有應用。另外，分子印跡技術目前在天然產物的提取分離研究中也有一定的應用。目前，以EA為模板分子的印跡聚合物(MIPs)用于多酚類成分的富集研究尚未見報道。本文采用沉淀聚合法合成EA-MIPS，并對其結構和性能進行表征，有望為天然藥物化學成分多酚的高選擇性分離、富集、純化提供一種新的途徑。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

UV-2550紫外-可見分光光度計，日本Shimadzu公司；5700型紅外光譜儀，美國Nicolet公司；TriStar3000全自動比表面積及孔隙度測定儀，美國麥克公司；Quanta 250型掃描電子顯微鏡，美國FEI公司；CHY-2型恒溫振蕩器，江蘇金壇富華儀器有限公司；SK-500B型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；HH-HS型恒溫水浴鍋，上海南陽儀器公司；GT10-1型高速臺式離心機，北京時代北利離心機有限公司。

鞣花酸(EA)(批號：BCTG -0302，純度98%)、槲皮素(QUE)(批號：BCTG-0238，純度98%)、沒食子酸(GA)(批號：BCTG-0177，純度98%)，均購自江西本草天工科技有限責任公司；丙烯酰胺(AM)，上海山浦化工有限公司；4-乙烯基吡啶(4-VP)、乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)、偶氮二異丁腈(AIBN)、甲醇、二甲基亞砜、乙酸，西隴科學股份有限公司。

1.2 實驗步驟

1.2.1 鞣花酸分子印跡微聚合物的制備采用沉淀聚合法制備MIPs。將模板分子(EA)和功能單體(AM、4-VP)溶解在裝有致孔劑的圓底燒瓶中，密封，常溫振蕩1 h預聚合。再加入交聯劑(EDMA)及0.03 g引發劑(AIBN)，通氮氣后密封，放置于水浴鍋中聚合24 h，得到聚合物。待反應完成后，加入甲醇-乙酸溶液(8∶2，V/V)超聲30 min，然后在離心機中5 000 r/min離心，反復幾次，直到上清液中紫外檢測不出模板分子。然后用甲醇洗至中性，得到MIPS，最后于60 ℃烘干。非分子印跡聚合物(Nonimprinted Polymers,NIPS)除不加入模板分子外，其余步驟同上。

1.2.2 印跡聚合物制備條件的選擇MIPs制備以功能單體的用量(A)、交聯劑用量(B)、溶劑用量(C)和溫度(D)4個因素進行正交試驗，各因素分別取3個水平，以靜態吸附容量(Q)作為考察指標，研究上述因素對MIPs的性能影響，其因素水平見表1。

表1 因素水平表

1.2.3 靜態吸附實驗稱取一系列質量為25 mg的MIPs和NIPS,置于10 mL的離心管中，分別加入濃度為10、20、40、60、80、100 μg/mL的EA標準溶液5 mL，恒溫吸附至飽和，離心，取上清溶液適當稀釋后，用紫外分光光度計測定吸光度，計算聚合物對底物的吸附容量(Q)。再根據Q值與初始濃度c0繪制等溫吸附曲線。Q=(c0-cs)·V/m，式中Q為靜態平衡吸附容量(μmol/g)，c0為模板分子始濃度(μmol/L)，cs為吸附平衡時濃度(μmol/L)，V為底物溶液的體積(mL)，m為聚合物的使用量(mg)[1]。

1.2.4 動態吸附實驗準確稱取MIPS和NIPS各6份，每份25 mg，置于10 mL的離心管中，然后再加入5 mL 60 μg/mL的EA標準溶液并混合均勻，室溫下分別振蕩1 h、2 h、4 h、6 h、8 h后，離心，取上清液適當稀釋后，用紫外分光光度計分別測定每組樣品的吸光度。根據上述方法計算出聚合物對底物的Q值，繪制吸附動力學曲線，確定吸附飽和時間。

1.2.5 選擇性能評價實驗準確稱取MIPS25 mg，分別加入20 μg/mL的EA、GA、QUE標準溶液各5 mL，于室溫下振蕩6 h。按照上述方法計算MIPs對底物的結合量，分別求出聚合物靜態分配系數(K)和分離因子(α)[20]，研究MIPs對不同底物的特異吸附能力。其中，K=ca/cs，α=Ki/Kj，式中ca為結合底物的濃度，cs為吸附平衡時底物在溶液中的濃度，i為模板分子，j為底物分子；規定若j=i，α=1；若α<1，表明MIPS對其模板分子沒有選擇性；若α>1，則表明MIPS對模板分子具有一定的選擇性。

2 結果與討論

2.1 功能單體的選擇

通常，酸性的模板分子適合堿性的功能單體，堿性的模板分子則適合酸性的功能單體。由于EA是多酚類化合物，具有一定的酸性，從理論而言堿性的功能單體有利于功能單體形成穩定的主客復合物。本實驗取4-VP和AM兩種功能單體，分別合成得到EA-MIPs，通過對EA不同質量濃度(20、40、60 μg/mL)溶液的靜態吸附試驗，計算吸附EA的濃度。得到功能單體對EA-MIPs性能的影響，如圖1所示。由圖可知，以4-VP為功能單體形成的MIPs的吸附容量顯著高于AM，故選擇4-VP作為功能單體。

圖1 功能單體對印跡聚合物的影響Fig.1 Effect of functional monomers on imprinted polymers

2.2 正交試驗結果

為了得到吸附效果較好的EA-MIPs，經單因素優化和相關參考文獻，確定模板分子和功能單體的摩爾比為1∶2～1∶6，模板分子與交聯劑的摩爾比為1∶10～1∶30，反應溶劑的用量為50～60 mL(1 mmol EA)，溫度為60～70 ℃，AIBN為30 mg。并進行4因素3水平的正交試驗，以靜態吸附容量作為考察指標，優化聚合物的合成條件。正交試驗結果見表2。由表可知，聚合反應的最佳條件是A3B1C3D2，即n(EA∶4-VP∶EDMA)=1∶6∶10，溶劑用量為70 mL，聚合溫度為65 ℃。由R值可知A的影響最大，其次是B、D、C。

表2 正交試驗結果

2.3 比表面積測定和掃描電鏡結果分析

根據不同的掃描電鏡圖譜(圖2)和比表面積測試結果(表3)可知，MIPS1、MIPS9的粘連很嚴重，而且粒徑較大,比表面積較小；MIPS2、MIPS3、MIPS4的大小很不均一；MIPS5粘連嚴重，球形不規則，比表面積小；MIPS6發生團聚，分散性較差；總體來說，MIPS7、MIPS8微球光滑均勻，球形度較好，且比表面積大，吸附能力強。

表3 比表面積測試結果

圖2 不同MIPS的掃描電鏡圖Fig.2 Scan electron microscopic images of different MIPS

2.4 鞣花酸印跡聚合物的表征

將真空干燥后聚合物用掃描電鏡和傅里葉紅外(IR)光譜表征。由掃描電鏡結果可知，MIPS7微球形態最好，故對模板分子、MIPS7進行紅外光譜分析，見圖3。由于EDMA具有α,β不飽和酯結構，其C=O的伸縮振動峰應該在1 715～1 730 cm-1，從紅外光譜圖可以看出，MIPS的IR圖中吸收峰為1 735 cm-1，為飽和酯的C=O的伸縮振動峰，表明聚合成功。MIPS的IR圖與EA的IR圖比較，前者少了EA中的3組特征峰，芳環內酯C=O特征雙峰1 735 cm-1、1 700 cm-1，共軛苯環特征峰1 600 cm-1、1 580 cm-1、1 500 cm-1及指紋區的C-H的面外彎曲振動峰750 cm-1，說明模板分子已洗脫。

圖3 MIPS(a)和EA(b)的紅外光譜圖Fig.3 Infrared spectrograms of MIPS(a) and EA(b)

2.5 靜態試驗吸附結果和Scatchard分析

由正交試驗結果可知MIPS7有較好的吸附性能，故用MIPS7來進行等溫吸附實驗。從圖4可知聚合物對底物的Q隨EA濃度的增大而增大，且在高濃度范圍內，吸附達到飽和狀態。同時，不同濃度條件下MIPS的Q均大于對應的NIPS。這是因模板分子經過洗脫后在聚合物的空間和結構上留下“印跡空穴”，當與模板分子相似的結構進入“空穴”后會產生特異性結合。而空白印跡聚合物為不含有與模板分子結構相似的“空穴”。為了更直觀準確地評價MIPS的吸附性能，對EA與目標分子的結合采用Scatchard方程[21]來反映，Scatchard方程為：Q/cEA=(Qmax-Q)/Kd，Q為吸附容量，μmol/g；Kd是結合位點平衡離解常數；Qmax是結合位點最大吸附容量，μmol/g；cEA是底物在上清液中的平衡質量濃度，μmol/L；所得方程分別為：y1=0.01072x+0.1192，聚合物結合位點的平衡常數Kd=93.26 μmol/mL，最大表觀結合量Qmax=11.11 μmol/g；y2=-0.4713x+5.2802，聚合物結合位點的平衡常數Kd=2.12 μmol/mL，最大表觀結合量Qmax=11.19 μmol/g。由圖5可知有兩條較好的線性關系的直線，可能是由于EA和目標分子之間以不同的配比進行組合，形成了兩種性質不同的空穴。

圖4 MIPS和NIPS等溫吸附曲線Fig.4 Isothermals adsorption curve of MIPS and NIPS

圖5 MIPS的Scatchard方程Fig.5 Scatchard equation for MIPS

2.6 動態吸附性能研究

EA動態吸附結果如圖6，MIPS7和NIPS7前6 h內，隨著時間的延長，Q都逐漸增大且MIPS7的Q要高于NIPS7。當振搖6 h后，隨著時間的增加，Q變化不大，故在6 h時EA MIPS達到吸附飽和。

圖6 MIPs和NIPS的動力吸附曲線Fig.6 Kinetic adsorption curves of MIPs and NIPS

2.7 選擇性識別性能

為考察EA-MIPS的選擇性識別能力，選擇沒食子酸、槲皮素作為干擾物進行選擇性吸附試驗。MIPS7具有較好的吸附性能，因此本實驗考察MIPS7對各底物分子的選擇性。結果如表4所示，MIPS7對EA的分配系數明顯高于GA和QUE，且分離因子α>1，表明MIPS對EA的吸附具有選擇性。

表4 MIPS對各底物的識別性能

3 結論

采用沉淀聚合法確定鞣花酸(EA)分子印跡聚合物制備適宜條件如下：70 mL二甲基亞砜溶液(1 mmol EA)為致孔劑，4-VP為功能單體，65 ℃恒溫水浴法攪拌。在n(EA∶4-VP∶EDMA)=1∶6∶10時，合成的聚合物在6 h時達到最大吸附容量，為10.865 μmol/g，分離因子α均超過1，表明MIPS對鞣花酸的吸附有特異性。方法可選擇性識別EA，為EA及酚酸類成分分離富集提供參考。