具有聚集誘導(dǎo)發(fā)紅光性質(zhì)的鄰菲啰啉釕配合物的合成及其細(xì)胞成像研究

王 慧*， 胡 磊， 沈?qū)W彬， 吳運(yùn)軍

(皖南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，安徽蕪湖 241002)

發(fā)光金屬配合物在分子傳感器、生物成像探針和光催化等諸多研究領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用價(jià)值，已經(jīng)成為近年來科學(xué)研究的熱點(diǎn)[1,2]。一般來說，有機(jī)配體和金屬配合物在稀的非水溶液中表現(xiàn)出明亮的熒光，但在聚集狀態(tài)下或固態(tài)下由于聚集引起的猝滅(ACQ)而發(fā)出非常微弱的熒光。2001年，唐本忠研究小組報(bào)道了一種與ACQ完全相反的新現(xiàn)象，稱之為“聚集誘導(dǎo)熒光增強(qiáng)”(AIE)效應(yīng)[4]。AIE材料在良性溶劑中不發(fā)光或發(fā)出微弱的熒光，但這些材料在聚集態(tài)或固態(tài)下發(fā)出強(qiáng)烈的熒光。隨著對AIE研究的不斷深入，研究者們提出了很多機(jī)理，如形成J-聚集體、扭轉(zhuǎn)的分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移、分子內(nèi)平面化、非緊密堆積、形成特殊激基締合物等[5 - 7]。目前AIE材料已經(jīng)廣泛應(yīng)用于生物傳感、細(xì)胞亞細(xì)胞器成像和光動(dòng)力學(xué)等研究方面[8 - 11]。雖然很多具有AIE效應(yīng)的分子被報(bào)道，但大多數(shù)AIE分子的發(fā)射波段處于藍(lán)綠光區(qū)，而具有紅光發(fā)射特性的AIE材料(發(fā)射波長>600 nm)的種類和數(shù)量非常有限。紅光AIE材料具有穿透能力強(qiáng)、對生物樣品的損傷小、信噪比高等優(yōu)勢，但也存在量子產(chǎn)率低、光穩(wěn)定性差等缺點(diǎn)[12]，因此，設(shè)計(jì)合成具有紅光AIE效應(yīng)的分子具有重要的科學(xué)意義。

Ru(Ⅱ)配合物具有較大的斯托克斯位移、好的光穩(wěn)定性、長的熒光壽命等優(yōu)勢，已受到科研工作者越來越多的青睞[13,14]。鄰菲啰啉具有較強(qiáng)的配位能力、好的平面性、容易修飾等優(yōu)點(diǎn)，與Ru(Ⅱ)形成的配合物，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于非線性光學(xué)材料、抗腫瘤藥物和DNA探針等領(lǐng)域[15,16]。基于此，我們以4-丁氧基苯甲醛和鄰菲啰啉雙酮為原料，設(shè)計(jì)合成了一種新型的鄰菲啰啉衍生物L(fēng)，并于[Ru(phen)2]Cl2組裝成相應(yīng)的配合物L(fēng)Ru，在分子中引入丁基不僅能夠增加電子的離域，而且能夠提高分子的溶解性。研究了配合物L(fēng)Ru在不同極性的溶劑及不同體積比的乙醇和水混合溶液中的光學(xué)性質(zhì)。初步探索了配合物L(fēng)Ru在Hela細(xì)胞中的成像情況。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Bruker Avance 600核磁共振儀(美國，布魯克公司)；solanX 70 FT-MS質(zhì)譜儀(美國，布魯克公司)；Nicolet FT-IR-is5紅外光譜儀(KBr壓片)(日本，島津有限公司)；UV-5900PC型紫外分光光度計(jì)(上海元析儀器有限公司)；HITACHI F-4600熒光分光光度計(jì)(日本，日立公司)；INFINITE 200 PRO多功能酶標(biāo)儀(瑞士，Tecan公司)；Leica TCS SP8激光共聚焦顯微鏡(德國，徠卡公司)。

鄰菲啰啉(99%)，溴代正丁烷(99%)，對羥基苯甲醛(98%)，NH4Ac，六氟磷酸鉀(KPF6,99%)，三氯化釕水合物(35.0%～42.0% Ru basis)，氯化三(2,2′-聯(lián)吡啶)釕(Ⅱ)·六水(98%)，其它試劑均為分析純，購自阿拉丁試劑有限公司。

1.2 LRu的合成

1.2.1 化合物L(fēng)的合成在250 mL三口燒瓶中，依次加入0.74 g(3.5 mmol)鄰菲啰啉雙酮[17]，0.62 g(3.5 mmol)4-丁氧基苯甲醛[18]，5.75 g(75 mmol)NH4Ac和75 mL冰HAc，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，120 ℃反應(yīng)4 h，反應(yīng)結(jié)束后，冷卻至室溫后，倒入大量冰水中，用飽和K2CO3溶液調(diào)節(jié)pH至7，有固體析出，減壓抽濾，粗產(chǎn)物用甲醇重結(jié)晶，得淡褐色固體0.55 g，產(chǎn)率：42.9%。

1H NMR(600 MHz,d6-DMSO)：δ:8.98(d,J=4.0 Hz,2 H),8.87(d,J=8.0 Hz,2 H),8.18(d,J=8.5 Hz,2 H),7.77～7.79(m,2 H),7.11(d,J=8.4 Hz,2 H),4.02(t,J=6.4 Hz,2 H),1.74～1.66(m,2 H),1.49～1.38(m,2 H),0.91(t,J=7.4 Hz,3 H)。13C NMR(151 MHz,d6-DMSO)：δ:160.31,151.24,148.02,143.86,129.94,128.22,123.63,122.93,115.28,67.80,31.17,19.17,14.14。

1.2.2 配合物L(fēng)Ru的合成在100 mL三口燒瓶中，依次加入0.17 g(0.35 mmol)[Ru(phen)2]Cl2[17]，0.33 g(0.33 mmol)化合物L(fēng)和50 mL甲醇，氮?dú)獗Ｗo(hù)下，回流反應(yīng)24 h，反應(yīng)結(jié)束后，向其中加入KPF60.92 g(5 mmol) 繼續(xù)反應(yīng)4 h，反應(yīng)液經(jīng)減壓蒸餾除去甲醇得固體，然后用15 mL二氯甲烷溶解，減壓抽濾得濾液，無水MgSO4干燥過夜，所得粗產(chǎn)物經(jīng)硅膠柱層析分離，洗脫溶劑為二氯甲烷/甲醇(V/V=50/1)混合溶劑，得紅色固體0.15 g，產(chǎn)率：41.6%。

配合物L(fēng)Ru的合成路線見圖1。

圖1 配合物L(fēng)Ru的合成路線Fig.1 Synthesis routes of complex LRu

IR(KBr,cm-1):3451,2929,1611,1481,1456,1427,14906,1365,1250,1177,838,739,720,557。1H NMR(400 MHz,d6-DMSO)：δ:14.16(s,1 H),9.05(t,J=8.6 Hz,2 H),8.78(d,J=8.2 Hz,4 H),8.40(s,4 H),8.25(d,J=8.7 Hz,2 H),8.17～8.05(m,4 H),8.01(d,J=5.2 Hz,2 H),7.87～7.72(m,6 H),7.23(d,J=8.8 Hz,2 H),4.10(t,J=6.5 Hz,2 H),1.82～1.70(m,2 H),1.57～1.40(m,2 H),0.97(t,J=7.4 Hz,3 H)。13C NMR(101 MHz,d6-DMSO)：δ:161.03,153.44,147.53,137.28,130.92,128.29,126.64,115.70,88.22,68.08,31.02,19.05,14.07。HR-MS:計(jì)算值:829.9300,測得值：829.0815 [M-2PF6]+。

1.3 細(xì)胞毒性測試與細(xì)胞染色

1.3.1 細(xì)胞毒性測試將人宮頸癌細(xì)胞(Hela)接種于96孔板上，在37 ℃和5%CO2條件下培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞密度長至85%左右時(shí)，向孔中加入配合物L(fēng)Ru，使其最終濃度分別為5、10、15、20、25 μmol/L，每組濃度設(shè)三個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，同時(shí)設(shè)置對照孔和調(diào)零孔。當(dāng)配合物L(fēng)Ru與Hela共孵育24 h后，每孔加入20 μL 的3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽溶液(MTT)(5 mg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，除去96孔板中的培養(yǎng)基(DMEM)，并加入100 μL DMSO，振蕩10 min，用酶標(biāo)儀測量波長490 nm處各孔的吸光度。

1.3.2 細(xì)胞染色將人宮頸癌細(xì)胞(Hela)接種于共聚焦培養(yǎng)皿上，在37 ℃和5%CO2條件下培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞密度長至65%左右時(shí)，進(jìn)行以下兩組實(shí)驗(yàn)：(1)配合物L(fēng)Ru與Hela細(xì)胞共孵育20 min；(2)首先移除培養(yǎng)皿中的DMEM，用磷酸鹽緩沖溶液(PBS)洗滌2次，然后加入1.5 mL 4%多聚甲醛培養(yǎng)15 min，用PBS洗滌2次，最后加入2 mL含有配合物L(fēng)Ru(10 μmol/L)的DMEM，繼續(xù)培養(yǎng)20 min。孵化好的Hela細(xì)胞用PBS洗滌3次，直接用于顯影。

2 結(jié)果與討論

2.1 配合物L(fēng)Ru的線性光學(xué)性質(zhì)

選取苯、四氫呋喃(THF)、乙酸乙酯(EA)、乙醇(EtOH)、乙腈、二甲基亞砜(DMSO)和水7種不同極性的溶劑，研究溶劑對配合物L(fēng)Ru吸收光譜和熒光光譜的影響。圖2A是配合物L(fēng)Ru在不同極性溶劑中的紫外-可見吸收光譜圖。配合物L(fēng)Ru在不同極性溶劑中的吸收峰位置幾乎不隨溶劑極性的變化而變化，只是吸收峰的強(qiáng)度略有差別。配合物L(fēng)Ru在不同極性溶劑中的最大吸收峰位于460 nm左右，可歸屬于配體到金屬的躍遷(LMCT)。為了更好的理解吸收光譜和電子結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系，利用密度泛函理論(TD -DFT/B3LYP)對配合物L(fēng)Ru的躍遷過程進(jìn)行計(jì)算，采用Gaussian 09程序，6-31G基組對C、H、N、O原子及LANL2DZ基組對Ru原子。圖3和表1是配合物L(fēng)Ru的分子軌道能級圖和理論計(jì)算的相關(guān)數(shù)據(jù)。由圖3和表1可知，理論計(jì)算出的配合物L(fēng)Ru最大吸收峰在458 nm左右，是最高占有分子軌道(HOMO)到最低未占分子軌道(LUMO)的躍遷，其中HOMO軌道上的電子云主要分布在配體L上，LUMO軌道上的電子云主要分布在中心金屬Ru原子和配體鄰菲啰啉上，可歸屬于配體到金屬的躍遷混有配體到配體的躍遷。理論計(jì)算出的最大吸收峰位置與實(shí)驗(yàn)測得的結(jié)果相符合，為解釋配合物L(fēng)Ru的紫外-可見吸收光譜提供了理論依據(jù)。

表1 配合物L(fēng)Ru的理論計(jì)算相關(guān)數(shù)據(jù)

圖3 配合物L(fēng)Ru的分子軌道能級圖Fig.3 Molecular orbital energy diagram for LRu

圖2B是配合物L(fēng)Ru在不同極性溶劑中的熒光光譜圖。配合物L(fēng)Ru的測試濃度為10 μmol/L，熒光光譜的測試條件為激發(fā)波長460 nm,狹縫寬度為10.0 nm，電壓為500 V。配合物L(fēng)Ru的最大發(fā)射峰在602 nm左右，斯托克斯位移為142 nm，且其發(fā)射峰位置隨溶劑極性的增加變化不明顯。以[Ru(bpy)2]Cl2(在乙腈溶液中的量子產(chǎn)率φ=0.062)為參比[19]，根據(jù)量子產(chǎn)率公式[20]計(jì)算得到配合物L(fēng)Ru在不同溶劑的中的量子產(chǎn)率分別為0.13(苯)、0.12(四氫呋喃)、0.10(乙酸乙酯)、0.04(乙醇)、0.10(乙腈)、0.36(二甲基亞砜)和0.35(水)。而且配合物L(fēng)Ru在DMSO和水溶液中的熒光強(qiáng)度比其他溶劑的強(qiáng)，以乙醇為例，LRu在水中的熒光強(qiáng)度約是其在乙醇中的8倍。在365 nm紫外燈照射下，配合物L(fēng)Ru在純乙醇(0%)中呈現(xiàn)出微弱的紅光，在水(99%)中呈現(xiàn)出明亮的紅色熒光，且在固體狀態(tài)下，LRu也發(fā)出明亮的紅色熒光，造成這一現(xiàn)象的原因可能是聚集誘導(dǎo)熒光增強(qiáng)。

圖2 配合物L(fēng)Ru(10 μmol/L)在不同溶劑中的紫外-可見吸收光譜(A)和熒光光譜(B)Fig.2 UV-Vis absorption spectra(A) and fluorescence spectra of complex LRu (c=10 μmol/L) in different solvents

此外，還探究了配合物L(fēng)Ru在PBS中的穩(wěn)定性。在相同的測試條件下，時(shí)間間隔為2 h，測試配合物L(fēng)Ru的紫外-可見吸收光譜和熒光光譜，從圖4中可以看出隨著時(shí)間的延長，配合物L(fēng)Ru的吸收峰位置和熒光強(qiáng)度沒有發(fā)生明顯的變化，說明配合物L(fēng)Ru具有好的穩(wěn)定性，可將其應(yīng)用于生物體內(nèi)。

圖4 在不同的時(shí)間節(jié)點(diǎn)配合物L(fēng)Ru在PBS中的紫外-可見吸收光譜(A)和熒光光譜(B)Fig.4 UV-Vis absorption spectra(A) and fluorescence spectra (B) of LRu (c=10 μmol/L) in PBS under different time

2.2 聚集誘導(dǎo)熒光性質(zhì)

選擇乙醇作為配合物L(fēng)Ru的良性溶劑，水作為不良溶劑，配制成不同含水量(fw=0、10、20、30、40、50、60、70、80、90、99%)的混合溶液，測試配合物L(fēng)Ru的熒光光譜，配合物L(fēng)Ru的測試濃度為10 μmol/L。如圖5所示，隨著水含量的增加，配合物L(fēng)Ru的熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)。當(dāng)fw=80%時(shí)，配合物L(fēng)Ru的熒光強(qiáng)度達(dá)到最大，比純乙醇增強(qiáng)約6.7倍，這是典型的聚集誘導(dǎo)熒光增強(qiáng)性質(zhì)，且熒光發(fā)射峰位置由590 nm紅移到602 nm。這是由于水分子的加入，降低了配合物的溶解性，使其聚集成顆粒，在聚集狀態(tài)下，配合物中單鍵的自由旋轉(zhuǎn)受到限制，抑制了激發(fā)態(tài)的非輻射躍遷，最終導(dǎo)致配合物的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)[7,21]。

圖5 (A) 配合物L(fēng)Ru在不同體積比乙醇/水混合溶液中的熒光光譜圖；(B) 配合物L(fēng)Ru的熒光強(qiáng)度與水體積分?jǐn)?shù)的關(guān)系Fig.5 (A) Fluorescence spectra of complex LRu in ethanol/H2O mixtures with different water fraction；(B) The changes of fluorescence peak intensity of complex LRu with different water fractions

2.3 細(xì)胞毒性測試和細(xì)胞顯影

首先利用MTT方法測試了配合物L(fēng)Ru的細(xì)胞毒性(圖6)，當(dāng)配合物L(fēng)Ru與Hela細(xì)胞作用24 h，細(xì)胞的存活率在80%以上，說明配合物L(fēng)Ru具有較低的細(xì)胞毒性，可將其安全地應(yīng)用于活細(xì)胞成像。為進(jìn)一步研究配合物L(fēng)Ru在細(xì)胞內(nèi)的分布情況，利用Leica TCS SP8激光共聚焦顯微鏡對配合物L(fēng)Ru進(jìn)行細(xì)胞成像研究。

圖6 配合物L(fēng)Ru與Hela細(xì)胞作用24 h后的細(xì)胞存活率Fig.6 Cell viabilities of Hela cells incubated with complex LRu for 24 h

將Hela細(xì)胞與10 μmol/L LRu共孵育20 min，如圖7所示，在細(xì)胞周圍觀察到強(qiáng)的紅色熒光信號，通過與明場圖疊加，發(fā)現(xiàn)熒光信號主要來源于細(xì)胞的細(xì)胞膜區(qū)域。同時(shí)研究了配合物L(fēng)Ru在不同焦平面下的細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)，如圖8所示，LRu在不同焦距下的熒光信號也主要來源于細(xì)胞膜區(qū)域。當(dāng)用4%多聚甲醛固定Hela細(xì)胞后(圖7)，發(fā)現(xiàn)配合物L(fēng)Ru主要著色于細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)部位。說明配合物L(fēng)Ru可靶向在活細(xì)胞的細(xì)胞膜部位。

圖7 配合物L(fēng)Ru在活細(xì)胞和固定的Hela細(xì)胞中的細(xì)胞成像圖Fig.7 Cell images of live and fixed Hela cells incubated with LRu

圖8 (A)在不同焦平面下配合物L(fēng)Ru孵育Hela細(xì)胞20 min后的共聚焦成像圖；(B) 配合物L(fēng)Ru在Hela細(xì)胞中的3D成像圖Fig.8 Confocal images of Hela cells incubated with LRu for 20 min under different focal lengths；(B) 3D imaging of LRu in Hela cells

高的光穩(wěn)定性有利于化合物長時(shí)間進(jìn)行細(xì)胞成像進(jìn)而追蹤細(xì)胞生理狀態(tài)的變化過程。配合物L(fēng)Ru的光穩(wěn)定性測試如圖9所示，用激光不間斷的掃描配合物L(fēng)Ru孵育的Hela細(xì)胞760 s，LRu的熒光強(qiáng)度在80%以上，說明配合物L(fēng)Ru具有比較好的光穩(wěn)定性。與文獻(xiàn)已報(bào)道的材料相比[22 - 25]，配合物L(fēng)Ru具有較好的光穩(wěn)定性、生物相容性、大的斯托克斯位移和較高的量子產(chǎn)率，且能靶向在活細(xì)胞的細(xì)胞膜部位。但其自身也存在一些不足，如配合物L(fēng)Ru的最大發(fā)射峰在602 nm左右，發(fā)射波長較短。

圖9 配合物L(fēng)Ru在細(xì)胞中的光穩(wěn)定性Fig.9 Photostability of LRu in cell imaging

3 結(jié)論

設(shè)計(jì)合成了一種新型的鄰菲啰啉釕配合物L(fēng)Ru，借助紫外-可見吸收光譜、熒光光譜、理論計(jì)算、MTT測試和共聚焦顯微成像系統(tǒng)地研究了配合物的光物理性質(zhì)及細(xì)胞成像。研究結(jié)果表明：(1)在不同體積比的乙醇和水混合溶液中，配合物L(fēng)Ru展現(xiàn)出明顯的聚集誘導(dǎo)熒光增強(qiáng)性質(zhì)，發(fā)射波長在602 nm左右，且當(dāng)含水量達(dá)到80%時(shí)，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)約6.7倍；(2)配合物L(fēng)Ru具有較高的細(xì)胞存活率和高的光穩(wěn)定性，可靶向活細(xì)胞的細(xì)胞膜部位。該研究結(jié)果為后期設(shè)計(jì)具有聚集誘導(dǎo)發(fā)紅光性質(zhì)的釕配合物提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和設(shè)計(jì)思路。