高穩(wěn)定性熒光納米SiO2的合成及其在磷脂巨型囊泡成像中的應(yīng)用

張衛(wèi)紅*， 魏露露， 劉菲菲， 李甜甜

(咸陽(yáng)師范學(xué)院化學(xué)與化工學(xué)院，陜西咸陽(yáng) 712000)

熒光納米顆粒在生物標(biāo)記、細(xì)胞成像、免疫分析等領(lǐng)域里有著廣泛的應(yīng)用前景[1 - 3]。目前常用的熒光納米顆粒有各種量子點(diǎn)[4 - 7]、納米Ag2S[8]、納米SiO2[9 - 11]、鑭系金屬[12]和熒光碳點(diǎn)[13]等。其中，熒光納米SiO2由于性質(zhì)穩(wěn)定、無(wú)細(xì)胞毒性而受到廣泛關(guān)注。熒光納米SiO2制備可用反相微乳液法[14,15]，但微乳液制備難度較大，后處理步驟也比較繁瑣。而制備納米SiO2最常用的St?ber法合成過(guò)程較為簡(jiǎn)單，如能對(duì)合成過(guò)程進(jìn)行合理設(shè)計(jì)，亦可制備出粒徑均勻的熒光納米SiO2顆粒[16]，該方法有望在熒光納米SiO2的合成及應(yīng)用領(lǐng)域發(fā)揮更大的作用。

磷脂巨型囊泡是尺寸在幾微米至上百微米的一類具有封閉薄球殼結(jié)構(gòu)、內(nèi)包微水相的分子有序組合體[17]，其殼層組成、結(jié)構(gòu)及尺寸均類似于生物體中的細(xì)胞，是一種模擬細(xì)胞簡(jiǎn)單而理想的模型[18]。磷脂巨型囊泡與納米顆粒的相互作用研究可以揭示生物礦化等生命現(xiàn)象，但兩者尺寸相差巨大，而且磷脂巨型囊泡僅可在內(nèi)外滲透壓均衡的水溶液中穩(wěn)定存在，用掃描電鏡等傳統(tǒng)檢測(cè)手段很難觀測(cè)到兩者的相互作用過(guò)程。基于此，將具有熒光性能的納米顆粒與磷脂巨型囊泡接觸，并借助熒光顯微鏡觀測(cè)兩者的相互作用過(guò)程就顯得尤為必要。本研究在St?ber法的基礎(chǔ)上，通過(guò)接枝異硫氰酸熒光素(FITC)并改變反應(yīng)溶劑種類的方式，合成了三種不同粒徑的熒光納米SiO2顆粒，對(duì)比分析了粒徑大小對(duì)熒光強(qiáng)度以及抗光漂白能力的影響。在此基礎(chǔ)上，通過(guò)簡(jiǎn)單混合的方法將熒光納米顆粒與磷脂巨型囊泡相接觸，通過(guò)熒光顯微鏡觀察分析熒光納米顆粒與磷脂巨型囊泡相對(duì)位置的變化，推測(cè)出兩者的相互作用機(jī)理模型。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器及試劑

激光粒度儀(Zetasizer Nano ZS3600，Malvern，英國(guó))；透射電鏡(H-7650，Hitachi，日本)；激光共聚焦顯微鏡(FV1200，Olympus，日本)；熒光光譜儀(RF5301，Shimadzu，日本)；倒置熒光顯微鏡(TE2000，Nikon，日本)。

異硫氰酸熒光素(FITC)，90%，麥克林試劑有限公司；氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)、無(wú)水乙醇、甲醇、異丙醇和三氯甲烷，均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；正硅酸乙酯(TEOS)和氨水(25%～28%)，均為分析純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；L-α磷脂酰膽堿，99%，Sigma公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 FITC-APTES制備2 mg的FITC溶于2 mL無(wú)水乙醇中，再加入40 μL的APTES，室溫下避光攪拌反應(yīng)24 h，即得熒光前驅(qū)體FITC-APTES。

1.2.2 不同粒徑熒光納米SiO2合成在磁力攪拌下，向100 mL圓底燒瓶中依次加入甲醇30 mL、氨水2.0 mL和TEOS 1.0 mL，室溫?cái)嚢? min后，向其中加入200 μL的FITC-APTES，遮光攪拌12 h；為有效保護(hù)熒光物質(zhì)，得到純凈的SiO2表面，再向其中加入200 μL的TEOS，繼續(xù)攪拌反應(yīng)12 h；反應(yīng)結(jié)束后，向溶液中加入50 mL純水，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去氨及甲醇，實(shí)現(xiàn)溶液置換，然后在純水中避光透析5 d除去游離的FITC分子，用純水稀釋至納米顆粒濃度為2 mg/mL，備用。

在配方相同的情況下將溶劑由甲醇改為乙醇和異丙醇即可得到粒徑依次增大的熒光納米SiO2。

1.2.3 熒光納米SiO2用于磷脂巨型囊泡成像磷脂巨型囊泡采用電形成法[19]制備，具體操作如下：取兩塊尺寸為6 cm×4 cm且表面鍍有氧化銦錫(ITO)的玻板，各吸取2 mg/mL的L-α磷脂酰膽堿的三氯甲烷溶液25 μL滴于兩塊ITO玻板上，刮涂均勻，將其置于真空烘箱中室溫抽真空2 h除去溶劑，取出后向涂有磷脂膜的一面左上角粘上一片2 cm長(zhǎng)的導(dǎo)電銅膠帶，再取外框尺寸為5 cm×3 cm、內(nèi)框尺寸為4 cm×2 cm、厚度為2 mm的且對(duì)角邊各有一個(gè)直徑為1 mm微孔的聚四氟乙烯模板框，將其兩面均涂上硅脂并置于兩片ITO玻板之間壓實(shí)，便組成了以ITO玻板為平行電極、以模板框所圍體積(約2 mL)的磷脂囊泡電形成腔，通過(guò)模板框的微孔向系統(tǒng)中間注入水性溶液，并通過(guò)波函數(shù)發(fā)生器向平行電極施加一定的弱交變電場(chǎng)，培育一段時(shí)間即可得到尺寸在微米級(jí)的磷脂巨型囊泡群。

向磷脂囊泡溶液中加入定量的熒光納米顆粒水溶液，室溫培育一段時(shí)間后在熒光顯微鏡下觀察兩者的相互作用過(guò)程，判斷熒光納米顆粒的成像效果。

2 結(jié)果與討論

2.1 熒光納米顆粒合成機(jī)理及基本性能

改進(jìn)St?ber法制備熒光SiO2的原理如圖1所示。首先根據(jù)FITC分子上的異硫氰基可以和硅烷偶聯(lián)劑APTES上的氨基進(jìn)行反應(yīng)的特點(diǎn)，將其共價(jià)偶聯(lián)于硅烷分子上，得到FITC-APTES熒光前驅(qū)體；而后該前驅(qū)體通過(guò)與TEOS共水解從而將熒光基團(tuán)接枝于納米SiO2膠體網(wǎng)絡(luò)中；最后通過(guò)再加入一部分TEOS進(jìn)行水解，將含有FITC分子的納米顆粒表面包裹起來(lái)，如此可以有效防止熒光泄漏和光漂白現(xiàn)象，延長(zhǎng)熒光納米顆粒的使用時(shí)間。

圖1 FITC-APTES及熒光納米SiO2合成示意圖Fig.1 Schematic representation of the synthesis of FITC-APTES and fluorescent nano-SiO2

在其它參數(shù)不變情況下，可改變醇溶劑的種類來(lái)調(diào)控納米SiO2的粒徑，甲醇是介電常數(shù)最大的且粘度最小的低鏈醇[20]，相同原料配比下以其為溶劑采用St?ber法合成的納米SiO2表面Zeta電位較高，顆粒間靜電排斥力大、勢(shì)壘較高，可以有效減少顆粒間的碰撞和相互聚集，進(jìn)而得到粒徑較小的納米顆粒；乙醇和異丙醇因介電常數(shù)依次降低以及粘度逐漸升高，以其為溶劑所合成的納米顆粒表面電位和勢(shì)壘相對(duì)較低，只有形成粒徑較大的顆粒才能保證其在溶液中穩(wěn)定存在。如圖2所示，采用三種醇為溶劑所得的熒光納米SiO2粒徑依次為30、150和260 nm左右，其動(dòng)態(tài)光散射檢測(cè)結(jié)果均表現(xiàn)出很好的粒徑單分散性，但在透射電鏡表征時(shí)，由于甲醇為溶劑所得的納米顆粒粒徑較小，表面能較大，因而在干態(tài)下呈現(xiàn)出一定程度的團(tuán)聚，而乙醇和異丙醇為溶劑所制得的熒光納米SiO2則表現(xiàn)出很好的球形度和尺寸均勻性。

圖2 不同醇為溶劑下合成的熒光納米SiO2透射電鏡(TEM)圖及動(dòng)態(tài)光散射圖Fig.2 TEM images and dynamic light scattering diagrams of fluorescent nano-SiO2 synthesized in different alcohol solvents(a) methanol;(b) ethanol;(c) isopropyl alcohol.

在進(jìn)行透射電鏡測(cè)試的同時(shí)，也采用激光共聚焦顯微鏡對(duì)熒光納米顆粒的熒光性能進(jìn)行測(cè)試。由于甲醇為溶劑所合成的熒光納米SiO2粒徑太小，已經(jīng)超出了激光共聚焦顯微鏡的分辨率下限(約150 nm)，未能得到清晰有效的影像；而用乙醇和異丙醇為溶劑的熒光納米SiO2則在490 nm波長(zhǎng)激發(fā)下發(fā)射出了清晰飽滿的綠色熒光(圖3)。熒光納米顆粒分散性較佳，且粒徑與透射電鏡測(cè)試值基本吻合，表明采用改進(jìn)St?ber法合成熒光納米顆粒較為成功。

圖3 乙醇(a)和異丙醇(b)為溶劑合成的熒光納米SiO2激光共聚焦顯微鏡測(cè)試圖Fig.3 Laser confocal microscopy images of fluorescent nano-SiO2 synthesized in ethanol(a) and isopropyl alcohol(b)

為判斷FITC分子的熒光性能是否會(huì)因?yàn)榘灿赟iO2膠體網(wǎng)絡(luò)中而發(fā)生改變，又采用熒光光譜儀對(duì)比分析了前驅(qū)體FITC-APTES與三種熒光納米顆粒的激發(fā)和發(fā)射光譜(圖4)。由圖可見(jiàn)，納米顆粒中熒光染料的激發(fā)光譜與發(fā)射光譜與游離態(tài)FITC-APTES相比僅出現(xiàn)了微小的移動(dòng)，應(yīng)該是SiO2膠體網(wǎng)絡(luò)與包覆于其中的FITC分子的相互作用而致，相較來(lái)說(shuō)FITC整體的熒光特性基本保持完整。除此之外，還可以明顯發(fā)現(xiàn)對(duì)于相同質(zhì)量濃度的熒光納米顆粒，其在熒光激發(fā)光譜和發(fā)射光譜的強(qiáng)度上均表現(xiàn)出了明顯的粒徑相關(guān)性，即甲醇為溶劑合成的最小粒徑的熒光納米顆粒熒光性最強(qiáng)，隨著粒徑逐漸增大，熒光納米顆粒的熒光性依次減弱，出現(xiàn)該現(xiàn)象的原因應(yīng)該在于相同質(zhì)量濃度下，納米顆粒粒徑越小，單位體積溶液中熒光納米顆粒的個(gè)數(shù)就越多，比表面積也越大，包覆于熒光納米顆粒中的FITC分子的熒光性能表現(xiàn)的也就越充分；隨著納米顆粒粒徑增大，單位液體體積內(nèi)納米顆粒個(gè)數(shù)減少，納米顆粒的表面效應(yīng)會(huì)相應(yīng)減弱，從而導(dǎo)致熒光性能出現(xiàn)了一定程度的下降。

圖4 FITC-APTES及三種熒光納米SiO2的激發(fā)和發(fā)射光譜Fig.4 Excitation and emission spectra of FITC-APTES and three fluorescent nano -SiO2

2.2 熒光納米顆粒的光穩(wěn)定性

為驗(yàn)證熒光納米顆粒在水溶液中的光穩(wěn)定性，對(duì)FITC-APTES和三種熒光納米顆粒樣品的水溶液用熒光光譜儀400 W氙燈照射90 min，每10 min測(cè)量一次熒光強(qiáng)度，以四種熒光樣品各自起始的熒光強(qiáng)度作為基準(zhǔn)，對(duì)比各樣品熒光強(qiáng)度隨照射時(shí)間的變化率，結(jié)果見(jiàn)圖5。由圖5可見(jiàn)，在強(qiáng)光照射一段時(shí)間后，幾種熒光樣品均表現(xiàn)出了一定程度的熒光衰減，不同的是處于游離態(tài)的FITC-APTES熒光衰減很快，在90 min照射后熒光強(qiáng)度就下降了53.96%，而其它三種熒光納米顆粒光強(qiáng)的下降則小的多，甲醇為溶劑合成的粒徑較小的熒光納米顆粒光強(qiáng)下降了18.51%，乙醇及異丙醇為溶劑合成的樣品熒光強(qiáng)度分別下降了12.61%和9.92%。粒徑越大的樣品熒光強(qiáng)度保護(hù)的越好，應(yīng)該是粒徑越大，包埋在SiO2膠體網(wǎng)絡(luò)中的熒光分子比例越高，殼層的存在不僅可以有效防止溶解在水中的少量氧進(jìn)入微球內(nèi)部而造成光氧化，也可以對(duì)外界的強(qiáng)光進(jìn)行一定程度的遮蔽。需要指出的是，雖然粒徑較小的甲醇樣品在強(qiáng)光照射下熒光損失較其它兩種納米顆粒的熒光損失稍高，但其本身的熒光強(qiáng)度依然高于其它兩種樣品，而且由于粒徑較小，其存儲(chǔ)穩(wěn)定性更是優(yōu)異，該樣品在室溫靜置狀態(tài)下存放6個(gè)月依然清澈透明，未出現(xiàn)沉降現(xiàn)象，而另外兩個(gè)樣品存放兩周后就出現(xiàn)了不同程度的沉降。鑒于甲醇為溶劑所制備的熒光納米SiO2優(yōu)異的熒光強(qiáng)度保持能力以及儲(chǔ)存穩(wěn)定性，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選用該樣品進(jìn)行磷脂巨型囊泡的成像研究。

圖5 FITC-APTES及三種熒光納米SiO2的光穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.5 Photostability experiment results of FITC-APTES and three fluorescent nano -SiO2

2.3 熒光納米顆粒用于磷脂巨型囊泡成像

按照電形成工藝制備出磷脂巨型囊泡群后，將熒光納米顆粒水溶液加入囊泡溶液中，熒光納米顆粒濃度控制在0.5 mg/mL，利用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察，分析熒光納米顆粒與磷脂囊泡的相互作用。圖6呈現(xiàn)了兩者初始接觸、培育10 h和培育24 h的熒光顯微鏡測(cè)試圖，以及對(duì)應(yīng)的微分干涉相襯(Differential Interference Contrast，DIC)圖片。由圖6(a)可見(jiàn)，當(dāng)熒光納米顆粒與巨型囊泡初始接觸時(shí)，囊泡在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)出較清晰的黑色影像，原因應(yīng)該是熒光納米顆粒加入時(shí)囊泡的封閉結(jié)構(gòu)已經(jīng)形成，熒光納米顆粒初始時(shí)幾乎全部處于囊泡外，囊泡內(nèi)部沒(méi)有熒光納米顆粒，因而僅呈現(xiàn)出黑色輪廓；隨著接觸時(shí)間延長(zhǎng)，出現(xiàn)了囊泡黑色影像逐漸減弱的現(xiàn)象。當(dāng)兩者接觸10 h后(圖6(b))，在熒光顯微鏡下幾乎看不到囊泡的輪廓了，應(yīng)該是在兩者接觸過(guò)程中，磷脂囊泡逐漸將一部分熒光納米顆粒包覆于其內(nèi)腔中，囊泡內(nèi)部熒光納米顆粒的濃度與外界游離的熒光納米顆粒的濃度基本相同時(shí)，內(nèi)外的熒光強(qiáng)度基本相當(dāng)，囊泡無(wú)法有效成像；隨著培育時(shí)間延長(zhǎng)，熒光納米顆粒在囊泡中不斷進(jìn)入和積累，內(nèi)部的熒光強(qiáng)度明顯高于外部。接觸24 h后(圖6(c))，已經(jīng)可以觀察到明亮清晰的囊泡影像。可見(jiàn)借助熒光納米顆粒不僅可以實(shí)現(xiàn)磷脂巨型囊泡成像，還可以間接揭示兩者的相互作用過(guò)程。

根據(jù)熒光顯微鏡的觀察結(jié)果，初步推斷熒光納米顆粒與磷脂巨型囊泡的相互作用過(guò)程如圖7所示。磷脂囊泡的雙分子層會(huì)因其外表面的熒光納米顆粒的吸附而發(fā)生變形，進(jìn)而逐漸將納米顆粒吸收于其內(nèi)腔中，過(guò)程類似于活細(xì)胞的“內(nèi)吞”過(guò)程[21]。

圖7 磷脂巨型囊泡與熒光納米SiO2相互作用示意圖Fig.7 Schematic diagram of the interaction between phospholipid giant vesicles and fluorescent nano-SiO2

為了驗(yàn)證所作出的熒光納米顆粒與磷脂巨型囊泡的相互作用機(jī)理推測(cè)，通過(guò)透射電鏡在低加速電壓(75 kV)下對(duì)體系進(jìn)行觀察，雖然大量的囊泡在電鏡測(cè)試環(huán)境下已經(jīng)破裂或融合，但仍然觀察到了囊泡內(nèi)包熒光納米顆粒的過(guò)程(圖8)，(a)圖顯示出一個(gè)亞微米級(jí)別囊泡表面變形及熒光納米顆粒進(jìn)入囊泡內(nèi)腔的現(xiàn)象，(b)圖則表現(xiàn)出一個(gè)微米級(jí)巨型囊泡內(nèi)部已經(jīng)有了一定比例的熒光納米顆粒，該檢測(cè)結(jié)果間接證明了磷脂巨型囊泡這種類細(xì)胞對(duì)吸附于其表面的納米顆粒具有一定的吸收和包載能力。

圖8 熒光納米顆粒進(jìn)入磷脂巨型囊泡內(nèi)腔透射電鏡(TEM)圖Fig.8 TEM images of fluorescent nanoparticles entering the cavity of phospholipid giant vesicle

3 結(jié)論

采用簡(jiǎn)單的改進(jìn)St?ber法，制備出了不同粒徑的熒光納米SiO2顆粒，發(fā)現(xiàn)粒徑對(duì)納米顆粒的熒光強(qiáng)度和光穩(wěn)定性均具有明顯的影響。粒徑越小納米顆粒熒光強(qiáng)度越強(qiáng)，但粒徑較大的納米顆粒則因?yàn)榭梢詫?duì)包載于其內(nèi)部的熒光分子有較好的遮蔽效果而表現(xiàn)出較好的抗光漂白能力。該類熒光納米SiO2顆粒由于具有較好的生物相容性，可以用于類細(xì)胞磷脂巨型囊泡成像，成像過(guò)程即是熒光納米顆粒在囊泡內(nèi)部的逐步聚集過(guò)程，當(dāng)磷脂囊泡將熒光納米顆粒吸收入其內(nèi)部并使內(nèi)部空間的熒光納米顆粒密度高于囊泡外游離的熒光納米顆粒密度時(shí)，即可獲得較好的成像效果。