血清miR-221與催乳素水平對老年非酒精性脂肪性肝病的早期診斷價值研究

唐改香 李婭 張旭

據估計，全世界非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)的患病率約為25%[1-4]，早期診斷NAFLD具有重要意義，病理活檢為有創性檢查，而超聲、磁共振及CT也存在各種缺陷[5-6]。近年來的研究表明miRNA在NAFLD的發生和發展中起著重要作用[7-11]。催乳素(PRL)是一種垂體來源的激素，最近被證明與脂肪肝的發生發展密切相關[12]。本研究的目的是探討miR-221和催乳素水平對NAFLD的早期診斷價值。

資料與方法

一、研究對象與分組

招募解放軍總醫院2019年1月至2019年12月行肝臟彩超的患者，納入標準：①飲酒量<20 g/d；②病理診斷為SNAFL或NASH。排除標準：①慢性肝炎病毒感染；②服用可致肝脂肪變性藥物(如糖皮質激素、他莫昔芬、胺碘酮、甲氨蝶呤或丙戊酸鈉)；③自身免疫性肝病；④存在急性感染；⑤不能接受肝臟活檢術；⑥嚴重器官功能不全；⑦經超聲或活檢診斷為肝纖維化或肝硬化；⑧惡性腫瘤；⑨1型糖尿病、甲狀腺機能亢進癥或甲狀腺功能減退癥、高催乳素血癥。所有患者均先行肝臟彩超篩查NAFLD，再對超聲確診患者行肝臟活檢以明確NAFLD的診斷，并使用SAF評分確定組織學分級和NAFLD分期，SNAFL以活檢標本中>5%的肝細胞脂肪浸潤為標準，NASH在SNAFL基礎上合并小葉內炎癥及干肝細胞氣球樣變性。本研究共納入65例NAFLD患者，其中SNAFL組40例，NASH組25例。同時招募30例健康老年體檢者作為對照。

二、儀器與方法

(一)血樣收集 NAFLD患者于肝活檢后1個月內，對照與初入院時在禁食狀態下采集血樣，所有樣品在4 ℃和1 500×g下離心10 min分離血清，然后在-80 ℃中保存。

(二)PRL定量 使用自動化學發光免疫分析儀IMMULITE 2000(英國西門子公司)對血清樣本進行PRL定量。

(三)RNA抽提及實時定量PCR 用miRNeasy serum/plasma kit (Qiagen Venlo,Nederland)(QIGEN公司)提取血清中miRNA，使用miScript II reverse transcription kit (QIGEN公司)對血清microRNA進行逆轉錄，使用Applied Biosystems TaqMan1MicroRNA Assays (Applied Biosystems公司)和ABI 7900HT PCR儀(Applied Biosystems公司)對血清microRNA進行定量。

miR-221正向引物GTTCGTGGGAGCTACAT-TGTCTGC；反向引物GTGTCGTGGAGTCGGCAA-TTC；以U6基因作為內參，U6正向引物 GTG-CTCGCTTCGGCAGCACATATATAC；U6反向引物AAAAATATGGAACGCTTCACGAATTTG。

三、統計學方法

結 果

一、miR-221和PRL在NAFLD患者與對照組血中的表達量

NAFLD組血清miR-221相對表達量為10.76±0.40，高于對照組的10.25±0.51；NAFLD組血清PRL值為(13.09±0.56)ng/mL，低于對照組的(13.99±0.52)ng/mL，差異均有統計學意義(P<0.01)。

二、miR-221和PRL對NAFLD的診斷效能評估

miR-221與PRL對NAFLD診斷的 AUC值分別為0.795(95%CI：0.702～0.899)及0.880(95%CI：0.805～0.955)，P<0.001。見圖1。根據ROC曲線確定的miR-221與PRL最佳靈敏度和特異度下截斷值分別為10.26和13.73。miR-221對診斷NAFLD的靈敏度、特異度、陽性預測值、陰性預測值及約登指數分別為63.3%、84.6%、83.3%、65.5%、0.48；PRL對診斷NAFLD的靈敏度、特異度、陽性預測值、陰性預測值及約登指數分別為83.3%、87.7%、91.9%、75.8%、0.71。

圖1 miR-221與PRL對NAFLD診斷的ROC曲線

三、miR-221和PRL在SNAFL與NASH患者血中的表達量

miR-221相對表達量由高至低依次為NASH組、SNAFL組、對照組(表達量分別為11.12±0.20，10.56±0.38，10.25±0.51，組間比較P<0.001)，PRL水平由高至低依次為對照組、SNAFL組、NASH組[滴度(ng/mL)分別為13.99±0.52，13.24±0.44，12.89±0.65，P<0.05]。

四、miR-221和PRL對SNAFL與NASH的診斷效能評估

miR-221與PRL對SNAFL與NASH診斷的 AUC值分別為0.862(95%CI:0.772～0.951)及0.710(95%CI:0.584～0.836)，P<0.001。見圖2。根據ROC曲線確定的miR-221與PRL最佳靈敏度和特異度下截斷值分別為10.75和12.96。miR-221對診斷SNAFL與NASH的靈敏度、特異度、陽性預測值、陰性預測值及約登指數分別為76.0%、85.0%、85.0%、76.0%、0.61；PRL對診斷SNAFL與NASH的靈敏度、特異度、陽性預測值、陰性預測值及約登指數分別為60.0%、82.5%、76.7%、68.2%、0.42。

圖2 miR-221與PRL對診斷SNAFL與NASH的ROC曲線

討 論

在筆者的研究中，發現miR-221在NAFLD患者血中表達高于對照組而PRL水平低于對照組。接下來筆者研究了miR-221與PRL對NAFLD的診斷效能，發現兩者ROC曲線下面積分別為0.795和0.880，有較好的診斷效能，但PRL的診斷敏感度與特異度均在80%以上，而miR-221的診斷特異度為84.6%，低于miR-221，敏感度只有63.3%，可見PRL的診斷效能優于miR-221,尤其是對于患者的篩查價值更大。

此外，筆者進一步探究了兩者對于NAFLD早期的兩個不同階段SNAFL與NASH的區分能力，miR-221相對表達量由高至低依次為NASH組、SNAFL組、對照組，PRL水平由高至低依次為對照組、SNAFL組、NASH組，可見兩者在不同階段NAFLD中也有表達差異。評估miR-221與PRL對區分SNAFL與NASH的診斷效能，發現兩者ROC曲線下面積均大于0.7，而且miR-221無論敏感度與特異度均優于PRL，可見盡管PRL對NAFLD患者的篩查效果優于miR-221，但miR-221對于SNAFL與NASH的區分能力優于PRL，后續研究及應用時應考慮具體情況選擇恰當的指標或將兩者結合使用。

綜上，血清miR-221及PRL對于老年NAFLD均有較好診斷效能，且PRL對NAFLD患者及正常人的區分效果優于miR-221，而miR-221對于區分SNAFL與NASH患者的效能優于PRL。