基于多息薄層色譜法的黃甲軟肝顆粒的鑒別研究

王宗權(quán) 黃朝情 黃志輝 高進(jìn) 張麗麗 張保獻(xiàn) 滕利榮

【摘 要】 目的：建立黃甲軟肝顆粒中六味藥的多息薄層鑒別方法。方法：對(duì)方中黃芪、丹參、三七、葛根、赤芍和柴胡六味藥采用薄層色譜鑒別法進(jìn)行定性鑒別。結(jié)果：所得到的多息薄層色譜分離度好，斑點(diǎn)清晰，方法穩(wěn)定。結(jié)論：建立的薄層方法有效的鑒別了黃甲軟肝顆粒中黃芪、丹參、三七、葛根、赤芍和柴胡，為建立中藥復(fù)方制劑的快速薄層色譜鑒別方法提供了思路。

【關(guān)鍵詞】 黃甲軟肝顆粒;多息薄層色譜法;定性鑒別

【中圖分類號(hào)】R286?? 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A??? 【文章編號(hào)】1007-8517（2021）10-0036-04

Identification of Huangjia Ruangan Granules an Multi-Information Thin-Layer Chromatography*

WANG Zongquan1 HUANG Chaoqing2 HUANG Zhihui4 GAO Jin3 ZHANG Lili3 ZHANG Baoxian3* TENG Lirong4

1.Yingkerui （Zhuhai） Innovative Pharmaceutical Manufacturing Co， Ltd， Zhuhai 519040， China;

2. Beijing yingkerui Pharmaceutical Research Institute Co， Ltd ， Beijing 102200， China;

3. Yingkerui （Hengqin） Pharmaceutical Research Institute Co， Ltd， New Drug Delivery System Sub Center of National Research Center for Modern Engineering and Technology of Traditional Chinese Medicine， Engineering Technology Research Center of Guangdong Aerosol Inhalation Preparation， Zhuhai， 519000， China;

4. Zhuhai College of Jilin University， Zhuhai 519041， China

Abstract：Objective To establish a Multi-Information Thin-Layer Chromatography of six drugs in Huangjia Ruangan granules. Methods Qualitative identification of Astragalus membranaceus （Fisch.） Bge. Var. mongholicus （Bge.） Hsiao， Salvia miltiorrhiza Bge.， Panax notoginseng （Burk.） F. H. Chen， Pueraria lobate （Willd.） Ohwi， Paeonia lactiflora Pall.， Bupleurum chinense DC. in Huangjia Ruangan granules by TLC. Results The TLC obtained by the Multi-Information Thin-Layer Chromatography method， the spots were separated better. The method is stable. Conclusion The established TLC method effectively identified Astragalus membranaceus （Fisch.） Bge. Var. mongholicus （Bge.） Hsiao， Salvia miltiorrhiza Bge.， Panax notoginseng （Burk.） F. H. Chen， Pueraria lobate （Willd.） Ohwi， Paeonia lactiflora Pall.， Bupleurum chinense DC. in Huangjia ruangan granules， which provided a new idea for the rapid TLC identification of compound preparations of traditional Chinese medicine.

Keywords：Huangjia Ruangan Granules; Multi-Information Thin-Layer Chromatography; Qualitative Identification

黃甲軟肝顆粒是純中藥復(fù)方制劑，由黃芪、鱉甲、靈芝、丹參等10 味中藥組成。具有益氣舒肝、活血軟堅(jiān)的功效。用于肝纖維化和早期肝硬化脾虛肝郁，氣血瘀阻證。癥見(jiàn)脅肋刺痛或脹痛，食欲不振，脘腹脹滿，大便溏爛，神疲乏力，面色晦暗，舌暗，苔薄，脈弦。薄層色譜法是中藥復(fù)方制劑鑒別中最常用的定性方法，具有分離效率高、操作方便、分析速度快、專屬性好等特點(diǎn)[1]。近年來(lái)，隨著新方法、新技術(shù)的應(yīng)用，薄層色譜鑒別技術(shù)取得了長(zhǎng)足的發(fā)展，如中藥薄層指紋圖譜[2]、加壓薄層色譜[3]、微乳薄層色譜[4]、二維薄層色譜[5]等。但目前常用的薄層色譜鑒別法多為一塊薄層板檢測(cè)一種供試品，使用一種展開劑及顯色劑的情況下，多數(shù)可鑒別出一種或兩種藥味，并且樣品前處理復(fù)雜。基于多息法、整體觀在中藥質(zhì)量控制中的應(yīng)用，針對(duì)中藥薄層色譜鑒別法的現(xiàn)狀，提出了多息薄層色譜鑒別法[6]。探索中藥復(fù)方制劑的多息薄層色譜鑒別技術(shù)，有利于提升中藥復(fù)方制劑的檢驗(yàn)水平，減少檢測(cè)成本，節(jié)約檢測(cè)時(shí)間和降低環(huán)境污染。本研究對(duì)黃甲軟肝顆粒中的黃芪、丹參、三七、葛根、赤芍、柴胡建立了多息薄層色譜鑒別方法，在2塊薄層板上鑒別了6味藥，為建立中藥復(fù)方制劑的快速薄層色譜鑒別方法提供了思路。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 HWS-26型數(shù)顯恒溫水浴鍋（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）;SQP型電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）;KQ-500DE型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）;WFH-201B型暗箱式紫外分析儀（上海嘉鵬科技有限公司）;DHG-9070A型鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）;硅膠G薄層板（青島海洋化分廠，10 cm×20 cm，厚度：0.2～0.25 mm）;硅膠 G薄層板（煙臺(tái)市化學(xué)工業(yè)研究所，10 cm×20 cm，厚度：0.2～0.25 mm）;點(diǎn)樣方式：接觸式條帶狀點(diǎn)樣。

1.2 試劑與試藥 香草醛、甲醇、三氯甲烷、甲苯、對(duì)二甲氨基苯甲醛、乙酸乙酯、乙醚、正丁醇、氨試液、硫酸等均為分析純。

黃芪甲苷對(duì)照品（批號(hào)：110781-201717）;葛根素對(duì)照品（批號(hào)：110752-201816）;芍藥苷對(duì)照品（批號(hào)：110736-201943）;丹參酮IIA對(duì)照品（批號(hào)：110766-201721）;三七皂苷R1對(duì)照品（批號(hào)：110745-201820）;柴胡皂苷a對(duì)照品（批號(hào)：110777-201912）;柴胡皂苷d對(duì)照品（批號(hào)：110778-201912）;三七對(duì)照藥材（批號(hào)：120941-201409）;柴胡對(duì)照藥材（批號(hào)：120992-201509）均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院。

黃甲軟肝顆粒，批號(hào)：20190615，由盈科瑞（橫琴）藥物研究院有限公司提供。

各藥味陰性樣品，是從處方中減去待鑒別藥味后按照已經(jīng)確定的工藝條件制備而成，均由盈科瑞（橫琴）藥物研究院有限公司提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 丹參、葛根、赤芍薄層鑒別

2.1.1 樣品的制備 稱取供試品顆粒3 g，研細(xì)，加入甲醇10 mL，超聲處理30 min，濾過(guò)，濾液40 ℃揮干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。另分別取缺丹參的陰性樣品、缺葛根的陰性樣品、缺赤芍的陰性樣品各3 g，同法制成陰性樣品溶液。再分別取丹參酮IIA、葛根素及芍藥苷對(duì)照品適量，分別加甲醇制成1 mL含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。

2.1.2 展開顯色 吸取上述供試品溶液4 μL和陰性樣品溶液各4 μL、對(duì)照品溶液各2 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，使呈條帶狀，先以三氯甲烷-甲醇-水（7∶2.5∶0.25）為展開劑，展開，展至約5 cm，取出，晾干，再以甲苯-乙酸乙酯（24∶1）為展開劑，展開，展至約8 cm，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，置105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，分別置日光和紫外光燈（365 nm）下檢視。

2.1.3 結(jié)果 供試品色譜中，丹參酮IIA對(duì)照品顯示紅色的斑點(diǎn)，樣品中相應(yīng)的位置上有紅色的斑點(diǎn)較明顯，對(duì)應(yīng)的陰性樣品無(wú)干擾。葛根素對(duì)照品顯示藍(lán)色熒光斑點(diǎn)，樣品中相應(yīng)的位置上有藍(lán)色熒光斑點(diǎn)較明顯，對(duì)應(yīng)的陰性樣品無(wú)干擾。芍藥苷對(duì)照品顯示藍(lán)紫色的斑點(diǎn)，樣品中相應(yīng)的位置上有藍(lán)紫色的斑點(diǎn)，對(duì)應(yīng)的陰性樣品無(wú)干擾。如圖1所示。

2.2 黃芪、三七、柴胡薄層鑒別

2.2.1 樣品的制備 稱取供試品顆粒3 g，研細(xì)，加入甲醇25 mL，超聲處理30 min，濾過(guò)，濾液水浴蒸干，殘?jiān)铀?5 mL使溶解，用乙醚振搖提取3次，每次25 mL，棄去乙醚液，水液用水飽和正丁醇振搖提取2次，每次25 mL，合并正丁醇液，用氨試液充分洗滌3次，每次25 mL，棄去氨試液，用正丁醇飽和水洗滌2次，每次20 mL，棄去水液，正丁醇液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。另分別取缺黃芪的陰性樣品、缺三七的陰性樣品、缺柴胡的陰性樣品各3 g，同法制成陰性樣品溶液。再分別取黃芪甲苷、三七皂苷R1及柴胡皂苷a對(duì)照品適量，分別加甲醇制成1 mL含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。繼取三七對(duì)照藥材0.5 g，加水25 mL回流提取30 min，放冷，濾過(guò)，濾液自“用乙醚振搖提取3次”起，同法制成對(duì)照藥材溶液。

2.2.2 展開顯色 吸取上述供試品溶液和陰性樣品溶液各4 μL、對(duì)照品溶液和對(duì)照藥材溶液各2 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，使呈條帶狀，以正丁醇-乙酸乙酯-水（4∶3∶5）的上層溶液為展開劑，展開，展至約17 cm，取出，晾干，噴以含2%對(duì)二甲氨基苯甲醛的40%硫酸溶液，80 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，分別置日光和紫外光燈（365 nm）下檢視。

2.2.3 結(jié)果 供試品色譜中，黃芪甲苷對(duì)照品顯示棕褐色斑點(diǎn)，樣品中相應(yīng)的位置上有棕褐色斑點(diǎn)，對(duì)應(yīng)的陰性樣品無(wú)干擾。三七對(duì)照藥材顯示4個(gè)紫色的斑點(diǎn)，樣品中相應(yīng)的位置上有紫色的斑點(diǎn)，三七皂苷R1對(duì)照品相應(yīng)位置上有相同的紫色斑點(diǎn)，對(duì)應(yīng)的陰性樣品無(wú)干擾。柴胡皂苷a對(duì)照品顯示黃綠色的熒光斑點(diǎn)，樣品中相應(yīng)的位置上有黃綠色的熒光斑點(diǎn)較明顯，對(duì)應(yīng)的陰性樣品無(wú)干擾。如圖2所示。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)按照處方中所含有藥味主要的化學(xué)成分的極性進(jìn)行初步分類，并且參照處方組成以及制備工藝，將欲鑒別的黃甲軟肝顆粒中6味藥，分為皂苷類成分及其他類成分。對(duì)藥典中各藥味的鑒別方法進(jìn)行細(xì)致分析，由于有些供試品制備過(guò)程及所用展開劑極性相似，故嘗試同步檢識(shí)。再查閱相關(guān)文獻(xiàn)，摸索不同比例的展開劑，經(jīng)過(guò)反復(fù)試驗(yàn)，尋找合適的展開條件。

其他類成分（比如黃酮類、單萜類、菲醌類）制備方法簡(jiǎn)單，直接用甲醇超聲提取制備。而皂苷類成分因樣品成分復(fù)雜，干擾較大，故將樣品前處理方法加以改進(jìn)。設(shè)計(jì)了2種供試品溶液的制備方法：①采用甲醇直接超聲提取制備;②采用甲醇超聲提取，乙醚萃取后棄掉，再用水飽和正丁醇萃取制備（用氨試液及正丁醇飽和水溶液洗滌）。結(jié)果表明，三味藥（丹參、葛根、赤芍）采用方法①可以達(dá)到斑點(diǎn)清晰，分離效果好，簡(jiǎn)便易行。另三味藥（黃芪、三七、柴胡）需采用方法②可以達(dá)到斑點(diǎn)清晰，分離效果好。由于黃芪、三七、柴胡均含皂苷類化合物，易溶于水、醇類等極性較大的溶劑，在水飽和正丁醇中有較大的溶解度。本研究用乙醚除去部分脂溶性雜質(zhì)，在水飽和正丁醇中提取。又由于一些黃酮類化合物對(duì)皂苷類化合物的薄層鑒別干擾較大，故萃取液必須進(jìn)行堿化，洗滌掉部分干擾成分，還可以使黃芪甲苷的含量提高（黃芪皂苷I、黃芪皂苷II堿化后可以轉(zhuǎn)化為黃芪甲苷）。這樣就得到了清晰的薄層色譜圖，陰性無(wú)干擾。

研究中采用硅膠預(yù)制薄層板考察了不同展開劑系統(tǒng)及比例的展開效果。在丹參、葛根、赤芍的薄層鑒別中，參考葛根藥材的展開劑三氯甲烷-甲醇-水（7∶2.5∶0.25）[7]進(jìn)行展開，由于丹參酮IIA在此條件下展開效果不好，故參考丹參藥材薄層檢測(cè)的二次展開方法對(duì)丹參酮IIA進(jìn)行鑒別，結(jié)果陰性無(wú)干擾，專屬性強(qiáng)，適合作為黃甲軟肝顆粒中丹參、葛根、赤芍薄層鑒別方法。在黃芪、三七、柴胡的薄層鑒別中，對(duì)展開劑進(jìn)行了選擇對(duì)比，正丁醇-乙酸乙酯-水（4∶3∶5）;三氯甲烷-甲醇-水（13∶7∶2）;三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水（15∶40∶22∶10）[8]等展開條件，經(jīng)多次展開試驗(yàn)，優(yōu)選出正丁醇-乙酸乙酯-水（4∶3∶5）為試驗(yàn)展開條件，其他展開劑下易出現(xiàn)邊緣效應(yīng)且樣品斑點(diǎn)分離度較差。根據(jù)文獻(xiàn)[9]報(bào)道，柴胡皂苷d的醚鍵在高溫或酸性條件下可斷裂生成柴胡皂苷b2。而黃甲軟肝顆粒制備時(shí)柴胡經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間水煮，故本方不能使用柴胡對(duì)照藥材及柴胡皂苷d來(lái)鑒別。

多息薄層鑒別法的優(yōu)勢(shì)在于實(shí)現(xiàn)了一板多信息鑒別，完成了6味藥的鑒別。樣品處理和展開程序及成本大大降低，有效提高了檢測(cè)效率，節(jié)約了成本，突破了藥典的傳統(tǒng)鑒別模式。本研究建立了黃甲軟肝顆粒的多息薄層色譜鑒別法，探索了一種簡(jiǎn)便、省時(shí)、高效的鑒別方法，提升了黃甲軟肝顆粒的質(zhì)量控制水平，為中藥復(fù)方制劑的質(zhì)量控制提供了思路。

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（收稿日期：2020-10-22 編輯：劉 斌）

基金項(xiàng)目：廣東省重點(diǎn)領(lǐng)域研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2019B020201006）;國(guó)家“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(xiàng)項(xiàng)目（2017ZX09301017）;首屆中國(guó)橫琴科技創(chuàng)業(yè)大賽項(xiàng)目。

作者簡(jiǎn)介：王宗權(quán)（1977-），男，漢族，碩士，高級(jí)工程師，研究方向?yàn)橹兴幮滤幯邪l(fā)。E-mail： wzq03yjs@163.com

通信作者：張保獻(xiàn)（1962-），男，漢族，碩士，研究員，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹兴幮聞┬脱芯颗c新藥開發(fā)。E-mail： zhangbaoxian@ykrskj.com