自噬基因CTSL表達與膠質母細胞瘤患者預后相關

夏少懷,李文才,夏學巍,王文波,陳 力

(桂林醫學院附屬醫院 神經外科,廣西 桂林，541000)

細胞自噬是存在于真核生物中進化上的一種保守的分解代謝過程，又被稱做“II型細胞死亡”其過程主要是將受損的細胞器和蛋白質輸送至溶酶體進行降解[1]。因此它對控制細胞內蛋白質和細胞器的質量和數量方面具有重要作用。自噬的失調會引起多種疾病的發生，包括神經退行性疾病、腫瘤、免疫性疾病及感染性疾病等[2-4]。在腫瘤疾病中，自噬通過清除受損的細胞器和異常表達的蛋白質從而減輕細胞的損傷，抑制腫瘤的早期發生發展[5]。然而也有研究表明，自噬使腫瘤細胞具有了有更加良好的應激耐受性，提高了腫瘤細胞的生存能力，并促進了其再生[6]。在化療過程中抑制自噬可以促進腫瘤細胞的死亡，降低耐藥性[7]。盡管有越來越多的文獻報道了自噬與腫瘤的關系，但對于二者之間的具體的關系仍舊沒有定論，進一步研究自噬與腫瘤的關系有其必要性。近年來，自噬相關基因預測乳腺癌、肝癌、膀胱癌患者的臨床預后得到了證實[8-10]，而對自噬與神經膠質母細胞瘤的相關性僅有少量文獻報道。

膠質母細胞瘤(GBM)是成人惡性腦腫瘤中最常見的腫瘤。病理分級為IV級，是世界衛生組織(WHO)腦腫瘤分類的最高等級。即便GBM患者術后進行標準化療和輔助放療，其中位生存時間仍然只有12～15個月[11]，針對其較低的生存時間，越來越多醫師探討GBM的治療方法，比如通過識別在實體瘤的腫瘤細胞和腫瘤微環境的主要成分中廣泛表達的CD155，使用重組脊髓灰質炎病毒治療膠質母細胞瘤[12]，利用嵌合抗原受體(CAR)改造的T細胞，靶向腫瘤相關抗原白細胞介素13受體α2(IL13Rα2)[13]。但是這些方法目前并不具備向臨床推廣的能力，其臨床有效性也僅在少數患者身上證實。近期有文獻報道了細胞自噬與膠質瘤之間的關系，提示自噬可能是膠質瘤發生發展的中必不可少的機制之一。一項III期臨床試驗顯示，唯一經美國食品藥品監督管理局(FDA)批準的且能夠抑制自噬的抗瘧疾藥物氯喹在GBM中具有抗腫瘤作用，其患者在手術、化療和放療后，中位生存期均有所增加[14]。通過藥理抑制劑抑制FH535抑制WNT-CTNNB1信號使得SQSTM1表達上調，可增加GBM中的自噬通量，從而誘導GBM細胞凋亡[15]。但大多數對于自噬在腫瘤發生作用的研究都是基于細胞系或者動物模型中的有限的自噬相關基因，自噬相關基因對于人體影響的預后價值尚未在GBM中得以體現。本研究基于多個數據庫綜合分析了自噬基因在GBM患者中的臨床病理相關性及其預后價值。

1 資料與方法

1.1 資料來源

從人類自噬數據庫HADb(http：//autophagy.lu/clustering/index.html.)獲得了232個自噬相關基因。從癌癥基因組圖譜(TCGA)獲取169個GBM樣本，5個正常樣本數據，包含了基因表達數據。在UCSC(https://xenabrowser.net)中下載了對應的臨床數據。使用GEPIA網站(http://gepia.cancer-pku.cn/index.html)中的數據(207個GBM樣本，163個正常樣本)及CGGA數據庫(http://www.cgga.org.cn/index.jsp)中的mRNA325數據集(II級膠質瘤樣本103個，III級膠質瘤樣本79個，GBM樣本139個)進行驗證和分析。

1.2 統計學方法

差異基因的篩選方法為limma包(版本1.30.4)中的Wilcoxon秩和檢驗，GO、KEGG分析使用clusterProfiler包(版本3.10.1)，KM分析及COX多因素分析均使用SPSS22.0(IBM Crop.)完成，COX分析使用的方法為Forward：LR,使用GraphPad Prism 8(GraphPad Software，Inc.)生成圖形。通過survivalROC(版本1.0.3)完成隨時間依賴性的ROC分析。臨床相關性分析使用beeswarm包(版本0.2.3)完成。GSEA分析使用軟件GSEA4.03(http://software.broadinstitute.org/gsea/index.jsp)，自噬基因相關圖基因來源于ARN(http://arn.elte.hu/)，數據分析使用的R軟件版本為R3.53。

2 結果分析

2.1 GBM中差異表達的自噬相關基因

通過在人類基因數據庫HADb下載總共直接或間接參與自噬的232個基因。提取TCGA中這些自噬相關基因的表達數據后，使用Wilcoxon秩和檢驗做差異分析，篩選標準為FDR <0.05和| log2(倍數變化)|>1。得出56個基因表達顯著高于正常腦組織，為上調基因。21個基因的表達明顯低于正常腦組織。為下調基因(見圖1)。運用箱線圖顯示這些基因在正常腦組織樣本及腫瘤樣本中的表達(見圖2)。

圖1 差異自噬基因火山圖和熱圖Fig.1 Differential autophagy gene volcano map and heatmap

圖2 差異自噬基因箱線圖Fig.2 Differential autophagy gene box plot注：77個ARG在腫瘤組織和正常腦組織的表達。紅點代表腫瘤組織樣本，綠色代表正常腦組織樣本。

2.2 膠質瘤中差異表達自噬基因的功能注釋

在GO富集分析中的具有顯著分析的生物學過程(BP)主要包含：調節自噬、凋亡信號通路的調控及細胞對外界刺激反應方面；細胞組分(CC)主要包含：自噬體膜和自噬小體；分子功能(MF)主要包含：泛素樣蛋白連接酶結合、半胱氨酸-類型肽鏈內切酶的活動及蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性。分析結果見圖3(P<0.001,FDR<0.05)。在KEGG富集分析中顯示，77個ARG與動物自噬、細胞凋亡、胰腺癌、類NOD受體信號通路、結直腸癌、膀胱癌、小細胞肺癌、ErbB信號通路、腫瘤壞死因子信號通路顯著相關(P<0.001,FDR<0.05)。分析結果如圖4所示。

圖3 GO分析結果Fig.3 Results of GO analysis

圖4 KEGG分析結果Fig.4 Results of KEGG analysis

2.3 自噬基因及臨床病理因素的生存分析

在剔除掉TCGA數據組中沒有生存數據的患者后，對數據進行預后評估。KM分析顯示，6個自噬基因(HSPA5、GAA、P4HB、CASP4、CTSL、MAP1LC3A)及Tmz 化療、Tmz長期化療、Tmz化療天數、Stupp方案、放療、術后放化療、術后腫瘤殘余、首次治療后腫瘤進展時間與GBM預后相關(P<0.05)，結果見表1及圖5。其中6個自噬基因、術后腫瘤殘余、腫瘤在6個月內有進展為高危因素；Tmz 化療、Tmz 長期化療、Tmz 化療天數、Stupp方案、放療、術后放化療、為保護因素。隨后，通過納入Kaplan-Meier分析有意義的及臨床上認為與GBM患者預后顯著相關的因素(KPS評分、Stupp治療方案、放療、術后腫瘤殘余、首次治療后腫瘤進展時間、腫瘤分型、IDH1 狀態、6個自噬基因)[16-18]進行COX分析，篩選出CTSL(P=0.007，HR=2.605，95%CI=1.303-5.211)和Stupp方案(P=0.032，HR=0.464，95%CI=0.230-0.936)作為GBM總體存活(overall survive,OS)的獨立預后指標(見表2)。

表1 GBM患者關鍵自噬基因與臨床病理參數的單因素分析Table 1 Single factor analysis of key autophagy genes and clinicopathological parameters in GBM patients

續(表1)變量患者數中位生存(d)HR(95%CI)Log-rankPG-CIMP是否缺失1114536033940.391(0.144-1.066)10.057CTSL高表達低表達80793004541.811(1.233-2.659)10.002CASP4高表達低表達80793624471.439(1.051-2.196)10.040GAA高表達低表達80793174471.488(1.017-2.178)10.039P4HB高表達低表達80793624271.514(1.032-2.221)10.032MAP1LC3A高表達低表達80793604271.138(1.017-2.495)10.008HSPA5高表達低表達80793564471.465(0.998-2.151)10.049

圖5 Kaplan-Meier分析的結果圖(A-V)Fig.5 Results of Kaplan-Meier analysis(A-V)

表2 COX分析結果Table 2 Results of COX analysis

2.4 隨時間依賴性的ROC分析

對CTSL預測生存的可靠性分析結果顯示單個自噬基因CTSL在1年，3年，5年生存率為(AUC=0.665，AUC=0.628，AUC=0.549)，其預測預后的可靠性仍需要探討(見圖6)。

圖6 隨時間依賴性的ROC分析Fig.6 Results of time-dependent ROC analysis

2.5 CTSL表達和臨床病理特征的關聯

為了探索CTSL在GBM中的表達與臨床病理的關系，從TCGA數據庫獲得并分析了mRNA表達譜。并列出有差異性的結果，如圖7(a-d)所示。CTSL表達的增加與非G-CIMP(P=0.015)，TMZ長期化療(P=0.012)，TMZ化療(P=0.012)，腫瘤亞型(P<0.001)相關.

圖7 TCGA隊列中CTSL表達與臨床病理變量之間的關聯Fig.7 Correlation between CTSL expression and clinicopathological variables in TCGA cohort

2.6 基于GEPIA網站和CGGA數據庫的驗證和分析

GEPIA的數據分析顯示CTSL表達在正常人和GBM患者中具有差異性，單因素分析顯示CSTL為高危因素,見圖8(LograngkP=0.007 9,HR=1.6)。CGGA數據庫的mRNA325數據集顯示：(1)GBM中CTSL的表達與II級膠質瘤、III級膠質瘤中CTSL的表達均具有差異性；(2)以CTSL中位值分組的Kaplan-Meier分析僅在GBM中有差異性(P=0.001 8)；(3)IDH野生型GBM及1p/19q 無缺失型GBM中的CTSL表達量更高(見圖9)。

圖8 GEPIA分析結果Fig.8 Results of GEPIA analysis

圖9 CGGA分析結果Fig.9 Results of CGGA analysis注：(A,B,C)CTSL的高低表達分組在II級膠質瘤、III級膠質瘤及GBM中KM分析(D)CTSL在II級膠質瘤、II級膠質瘤及GBM中的表達差異(E,F)CTSL在IDH突變數據及1p/19q 編碼數據中的表達。

2.7 基于GSEA的CTSL相關信號通路分析結果

根據CTSL表達的中位值將其分為高、低兩類，運用GSEA進行分析，在MSigDB集合(kegg.v6.2.symbols.gmt,h.all.v7.0.symbols.gmt,c5.all.v7.0.symbols.gmt)的富集中觀察到了顯著差異(P<0.05，FDR<0.05)。結果見圖10及表3，在溶酶體、類NOD受體信號通路、kras通路信號上調、活性氧通路、血管生成、低氧癥、細胞化療、巨噬細胞遷移、巨噬細胞遷移的監管等與自噬和腫瘤相關的途徑中，CTSL有顯著富集。

圖10 GSEA分析結果Fig.10 Results of GSEA analysis

表3 GSEA分析結果Table 3 Results of GSEA analysis

2.8 CTSL在自噬調節和膠質瘤中的作用

為了研究自噬基因CTSL在自噬調節和膠質瘤起到的作用，我們從自噬調節網絡(ARN)中提取了與它們直接相關的鄰居。ARN是一個包含自噬基因相互作用及預測數據的數據庫。[19]我們發現與CTSL直接相關的自噬基因為:COL18A1,CD74,IGFBP-3,C3.同時COL18A1和CD74還被證明與膠質瘤相關(見圖11)。

圖11 與CTSL相關基因圖Fig.11 Gene map related to CTSL

3 討 論

研究中的篩選出的77個差異自噬基因，GO和KEGG富集分析結果顯示了其在調節自噬和各種腫瘤方面具備重要作用。同類型研究顯示通過自噬基因在GBM中的集中富集在細胞凋亡，壞死，免疫力和炎癥反應中，并通過COX模型聯合Kaplan-Meier分析有意義的自噬基因，以風險值為分組，對于GBM的預后預測更顯著，其中自噬基因P4HB、HSPA5同樣為高危因素，但由于采取統計學方法及數據庫不同，最終篩選結果具有一定差異[20，21]。Kaplan-Meier生存分析顯示6個自噬基因(HSPA5、GAA、P4HB、CASP4、CTSL、MAP1LC3A)、術后腫瘤殘余、腫瘤在6個月內有進展、為高危因素；Tmz 化療、Tmz長期化療、Tmz 化療天數、Stupp方案、放療、術后放化療為保護因素。且臨床廣泛應用的STUPP方案在COX結果中被驗證為是一種保護因素，結果與其他實驗結果和臨床認知基本相符[21，22]。同時本研究顯示43天的TMZ化療(根據數據中位數分組)似乎更具有意義。但年齡分析并未顯示顯著的差異性，這與Brodbelt等人對膠質瘤的研究并不相符[23]，這可能與本文樣本較少有關。

CTSL是一種溶酶體酸性半胱氨酸蛋白酶，具有促進腫瘤轉移的功能，高表達的CTSL患者生存時間更短，與正常組織、II級膠質瘤組織、III級膠質瘤組織相比，CTSL在GBM中具有差異性表達，且在COX分析中CTSL的高表達被確定為一種獨立危險因素，有越來越多的研究顯示CTSL的表達與腫瘤的臨床及預后密切相關。在已有的研究中發現CTSL在人胃癌組織中具有顯著的高表達，通過作用于人胃癌中的CDP/Cux/VEGF-D途徑促進胃癌組織內的血管生成[24]。Dhivya在體內和體外實驗均證實了使用KGP94抑制CTSL的表達能使腫瘤細胞誘導的血管生成顯著減少，并提出與乳腺癌患者中CTSL的表達上調與復發和轉移發生率增加以及整體生存率下降密切相關[25]，其結論與本文GSEA結果顯示CTSL在血管通路富集結果相符。

臨床相關性分析顯示CTSL在Tmz化療后表達更高,而腫瘤細胞對Tmz的不敏感性和耐藥性是GBM患者治療失敗和預后不良的主要原因，自噬抑制劑在臨床、體外與體內模型中均表現出與臨床藥物替莫唑胺的優異協同作用[26]。馮建波等人的研究發現LRRC4與DEPTOR/mTOR復合物的相互作用抑制了GBM細胞的自噬并增加了GBM的Tmz治療反應[27]。而目前僅有動物實驗表明抑制CTSL的表達可以使G2/M細胞周期停滯從而增加人神經膠質瘤U251細胞的放射敏感性[28]。同時我們研究發現CTSL在非GCIMP型、間質型、IDH野生型及1p/19q無缺失型膠質母細胞瘤中為高表達，這幾種類型的GBM均被證實為膠質母細胞瘤的高危分型[29-31]，提示對通過抑制自噬基因CTSL的表達，對GBM的化療耐藥性及高危型GBM的預后可能具有改善作用，但這一結論仍需實驗證實。與II級膠質瘤、III級膠質瘤相比，CTSL在GBM中具有差異性表達，這提示CTSL的表達可能可以作為膠質瘤的診斷標準。

與CTSL直接相關的自噬基因為:COL18A1,CD74,IGFBP-3,C3。單個COL18A1基因編碼成人類膠原蛋白XVIII，而內皮抑素位于人類膠原蛋白XVIII的C端非膠原結構域的末端[32]，其通過調節Bcl-2表達影響內皮細胞的自噬[33]。且有研究表明經膠質瘤組織內皮抑素水平與惡性程度呈正相關[34]。CD74通過AMPK-mTOR-Skp2介導的自噬調節作用來抑制乙醇引起的的心肌功能障礙，炎癥和細胞凋亡[35]。同時Zeiner等人實驗表明人類神經膠質瘤中CD74的表達與患者的生存呈正相關[36]。IGFBP-3的表達在缺氧環境中會上調，當其GRP78結合后，會促進自噬和應激存活，在受到治療劑的挑戰時，可以明顯增強腫瘤的進展，也可以幫助腫瘤細胞存活[37]。與CTSL相關聯的C3`通過和ATG16L1之間的直接相互作用，使得自噬系統可以有效地靶向細胞[38]。這些結果表明，CTSL在某種條件下與其他自噬相關成分相互作用從而影響自噬和膠質瘤的進展。前期自噬通過吞噬腫瘤細胞來抑制自噬，后期由于腫瘤細胞的迅速生長，造成缺氧環境，從而激活自噬，反而保護腫瘤細胞，促進其增殖與后期的復發，此結果在相關文章中也有提及錯誤!未指定書簽[3，34，39]。

GBM作為一種惡性程度高，預后差的疾病，已經有學者通過生物信息學方法篩選GBM的核心基因，并提出基因KCNAB2可能為有效靶標[40]。本研究則進一步探討了自噬基因與GBM的關系，發現了自噬基因CTSL的高表達是獨立危險因素，并提出CTSL的高表達可能與化療耐藥性、高危型GBM的預后相關。不足之處在于自噬基因數據庫未能全部覆蓋，且由于膠質母細胞瘤惡性程度高，單一基因預測預后AUC值較低，文章的結論缺少實驗證據的支持。

4 結 論

1)自噬基因CTSL在膠質母細胞瘤患者中顯著高表達，在高危型和接受化療后膠質母細胞瘤患者表達量更高。

2)自噬基因CTSL高表達與膠質母細胞瘤患者生存時間負相關，COX分析顯示為獨立危險因素，有作為有效靶標的潛質。

3)與自噬基因CTSL相關的成分研究表明其在某種條件下CTSL與其他自噬相關成分相互作用從而影響自噬和膠質瘤的進展。