肝細胞來源的肝前體樣細胞對巨噬細胞的調控作用研究

彭媛 周徐 景宏舒 朱雪晶 史瑤平 王濤 崔丹 施東華 丁敏 鄢和新 翟博

人原代細胞可通過小分子組合逆轉化為肝前體樣細胞(HepLPC)，該細胞通過旁分泌作用可減輕動物的炎癥反應并且促進組織再生[1,2]。為了進一步探究該細胞對炎癥損傷環境及組織修復潛在調節作用及機制，現采用藥物誘導原代巨噬細胞極化的體外模型進行評價，以期為該細胞治療肝病的應用提供可靠的體外驗證模型及參考依據。

材料與方法

一、材料與試劑

冷凍保存的原代肝細胞購自上海瑞德肝臟有限公司；高糖DMEM培養基、青鏈雙抗、1640培養基購自上海源培生物科技股份有限公司；Trizol、Sybgreen、紅細胞裂解液購自上海碧云天生物科技公司；胎牛血清購自以色列Biological Industries公司；相關引物由上海華津生物合成。0.25% Trypsin-EDTA 購自美國Gibco公司；小鼠粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子 (GM-CSF)及白介素4(IL-4)購自上海近岸生物；脂多糖購自美國Sigma公司；F4/80、CD11c、CD206抗體購自美國Biolegend公司；IL6、IL1β、iNOS、IL10 ELISA試劑盒均購自聯科生物。

二、實驗方法

(一)肝細胞來源的肝前體樣細胞條件培養基的制備 將冷凍保存的原代肝細胞，置于37℃水浴鍋中快速解凍離心處理，將細胞培養在含有10%胎牛血清和2%青鏈雙抗的肝細胞增殖培養基(TEM)中，然后將細胞置于37℃、體積分數為0.05的CO2細胞培養箱中。每2～3天更換一次新鮮TEM培養基；當細胞覆率超過80%時使用0.25%的Trypsin-EDTA進行消化，并按照1∶3的比例接種入新的培養皿中。當細胞培養擴增到P3時，鏡下觀察細胞匯合率達80%，記錄細胞狀態，拍照并保存。將TEM培養基更換為無血清的高糖DMEM培養基，24 h后收獲細胞上清，300×g離心10 min后分裝保存于-20℃冰箱。

(二)小鼠骨髓來源的巨噬細胞的分離與培養 將8～10周成年C57小鼠脊椎脫臼處死后，立即取股骨，分離后放入培養皿中。去除股骨周圍的其余組織，1640培養基10%胎牛血清和5%青鏈雙抗清洗兩遍。用1 mL注射器吸取1640培養基沖洗股骨髓腔，將骨髓沖洗下來，用移液槍將骨髓團塊沖散，用70 μm細胞篩網過濾，500×g離心5 min。棄上清，用紅細胞裂解液重懸，靜置5 min，500×g離心5 min。棄上清，用1640培養基重懸，再離心，重復兩遍。棄上清，用1640培養基重懸后計數，按(8～10)×105/孔接種入12孔板。接種時加入小鼠GM-CSF 40 ng/mL。接種6～8 h后，將細胞轉移入新的培養皿中培養，每3天更換新鮮培養基：1640培養基10%胎牛血清和5%青鏈雙抗+小鼠GM-CSF 40 ng/mL。培養至第7天，巨噬細胞分化成熟。

(三)巨噬細胞體外定向極化誘導與鑒定 巨噬細胞經7 d誘導分化成熟后，LPS 100 ng/mL誘導巨噬細胞分化為M1型亞群；IL-4 40ng/mL誘導巨噬細胞分化為M2型亞群。分別用不同細胞因子刺激6 h后，胰酶消化巨噬細胞，流式細胞術進行表面標志物的鑒定，另外收取RNA以及細胞上清樣本，用于后續的實驗處理。

(四)HepLPC-CM與不同巨噬細胞亞群共孵育 將凍存備用的HepLPC-CM在4℃條件融化恢復至室溫，加入10%胎牛血清和2%青鏈雙抗。在LPS/IL4誘導6 h的基礎上，將培養上清換成HepLPCs-CM，再孵育6 h后，收取RNA樣本和細胞上清，用于后續的實驗處理。

(五)流式細胞術 巨噬細胞鑒定：收集細胞，消化離心后分別加入F4/80抗體與同行對照抗體，4℃避光孵育30 min，加入PBS，離心去上清，加入500 μL PBS上機。M1型巨噬細胞鑒定：收集兩種巨噬細胞亞群，在LPS誘導6 h的巨噬細胞中同時加入F4/80和CD11c抗體以及同行對照抗體，在IL4誘導6 h的巨噬細胞中加入F4/80及CD206抗體以及同行對照抗體；4℃避光孵育30 min，PBS清洗，離心去上清，加入500 μL PBS準備上機。

(六)實時熒光定量PCR 使用Trizol試劑從培養的細胞中提取RNA，進行反轉錄，得到cDNA，并以GAPDH為內參進行內部控制計算相關基因的表達量。PCR系統設置參數為20 μL體系，95℃ 5 min、95℃ 15 s、95℃ 5 min、60℃ 15 s、35 s，共40個循環；循環后使用機器默認程序進行熔解曲線采樣。后按照ΔΔCt方法分析基因轉錄數據并歸一化到管家基因GAPDH。引物序列見表1。

表1 PCR引物序列

(七)ELISA檢測炎性相關因子 采用ELISA試劑盒進行細胞培養上清中IL6、IL1β、iNOS、IL10因子的濃度檢測，在說明書指導下進行。

三、統計學處理

結 果

一、原代巨噬細胞及其亞群的細胞鑒別

GM-CSF刺激BMDM貼壁第 7天，顯微鏡觀察細胞狀態良好，見圖1。

(一)不同巨噬細胞亞群定向分化后表面標志物表達 BMDM在GM-CSF刺激第7天時，分別采用LPS(100 ng/mL)、IL-4 (40 ng/mL)誘導巨噬細胞分化為M1、M2型亞群；刺激6 h后采用胰酶消化巨噬細胞，采用流式細胞術。F4/80+是巨噬細胞總標記抗體，CD11c+是M1表型標志物，CD206是M2表型標志物。

F4/80+表達占比92.8%，即總巨噬細胞占比92.8%，符合BMDM實驗細胞純度，可在此基礎上進行后續實驗。LPS(100 ng/mL)刺激BMDM 6h時，F4/80+，CD11c+表達占比88.1%，即M1型巨噬細胞占比88.1%。IL4(40 ng/mL)刺激BMDM 6 h時，F4/80+，CD206+表達占比97.0%，即M2型巨噬細胞占比97.0%。

A:×10；B:×20圖1 GM-CSF刺激BMDM貼壁7 d光學顯微下表現

(二)不同巨噬細胞亞群定向分化后相關基因表達 細胞在LPS(100 ng/mL)條件下處理6 h后，M1相關基因表達均上調，LPS(100 ng/mL)處理6 h后的BMDM，IL6表達上調為823.200±174.500，IL1β表達上調為8.389±0.029，iNOS表達上調為24.650±1.196；而未處理的對照組細胞分別為1.054±0.473、1.000±0.026、1.015±0.244。

將細胞用IL4(40 ng/mL)處理6 h后，M2相關基因在IL4刺激下均上升，相對于未處理的BMDM，IL4(40 ng/mL)處理6 h后的BMDM，CD206表達上調為114.000±3.579，IL10表達上調為2.634±0.028，ARG1表達上調為53.260±8.083；未處理的BMDM細胞中的表達分別為1.005±0.140，1.098±0.640，1.000±0.027。

二、HepLPC-CM抑制M1型巨噬細胞的極化

(一)HepLPC-CM共培養后，M1型巨噬細胞極化相關基因的表達顯著下降 在誘導M1型巨噬細胞的基礎上，用HepLPC-CM處理6h，收集相應RNA樣本，進行基因表達分析。相對于陽性對照處理組，在HepLPC-CM處理條件下，M1相關基因表達顯著下調。HepLPCs-CM 處理6 h，IL6表達為346.300±20.810，IL1β表達為11.290±0.10，iNOS表達為169.800±9.711；而陽性對照處理組分別為1207.000±115.700、83.500±0.066、807.100±42.190。

(二)HepLPC-CM共培養后，M1型巨噬細胞培養上清中炎性因子的表達水平下降 收集上述處理條件的細胞培養上清樣本，ELISA檢測上清樣本中相應炎性因子的表達。相對于陽性對照處理組，在HepLPC-CM處理條件后，上清中炎性因子分泌減少。IL6分泌為(138.700±32.130)pg/(mL×105cell)，IL1β分泌為(0.710±0.019)pg/(mL×105cell)，iNOS分泌為(0.095±0.001)pg/(mL×105cell)；而陽性對照處理組分別為242.100±0.187/5.108±0.018、(10.020±0.653)pg/(mL×105cell)。

三、HepLPC-CM可促M2型巨噬細胞相關標志物及基因的表達

(一)HepLPC-CM促進M2型巨噬細胞極化相關標志物及基因的表達 在誘導M2型巨噬細胞的基礎下，HepLPCs-CM處理6h，收集相應RNA樣本，進行基因表達分析。相對于陽性對照處理組，HepLPCs-CM處理條件下，M2相關基因表達上調。HepLPCs-CM 處理6h，CD206表達為40.88±0.1768，IL10表達為22.2±0.1414，ARG1表達為32.25±0.2121；而陽性對照處理組分別為33.65±0.465、10.277±0.169、25.060±0.585。

(二)HepLPCs-CM促進M2型巨噬細胞組織修復相關因子IL-10的表達 收集上述處理條件的細胞培養上清樣本，ELISA檢測上清樣本中相應炎性因子的表達。相對于陽性對照處理組，在HepLPCs-CM處理條件后，檢測上清中炎性因子IL10分泌增加。IL10分泌為108.052±0.472 pg/(mL×105cell)

討 論

免疫效應細胞在微環境因素的刺激下會分化成具有不同表型的亞細胞型[3]，這些亞型細胞在不同的免疫微環境中表現出的不同應答狀態和功能表型，對疾病的發生發展起著重要作用。作為免疫細胞中極為重要的一類細胞，巨噬細胞被認為在不同因素誘導下可出現兩種經典的細胞亞群，即M1型巨噬細胞和M2型巨噬細胞[4]。二者功能截然不同，M1型巨噬細胞促進炎癥反應，通過產生大量促炎性細胞因子如IL-1β、TNF-α、IL-6以及一氧化氮(nitrogen monoxide,NO)和活性氧(reactive oxygen species,ROS)介導機體的炎癥反應；M2型巨噬細胞主要產生免疫調節因子IL-10等，參與Th2 細胞型免疫應答，抑制炎癥和纖維化，在組織的修復過程中具有重要作用[5]。越來越多的證據表明不同巨噬細胞亞群在肝病的發生發展中起著重要的作用[6]。在非酒精性脂肪肝病(NAFLD)和非酒精性脂肪肝炎(NASH)中，巨噬細胞參與脂肪變性、炎癥和纖維化[7]。在急性肝損傷中，巨噬細胞被激活，導致細胞因子和趨化因子的釋放。肝巨噬細胞根據損傷的階段發揮不同的功能，可能加重損傷或促進組織修復過程[8]。因此通過調節巨噬細胞亞群介導的炎癥損傷與組織修復反應可能是治療肝病的一種新型策略。

本研究團隊在前期工作中，通過小分子組合將人原代細胞可逆轉化為HepLPC。該細胞在體外可規模化培養，有望成為治療肝病的細胞來源。為了進一步

探究該細胞潛在的作用機制，采用原代巨噬細胞體外極化模型進行了探究。研究顯示，HepLPC的條件培養基可以抑制LPS誘導的巨噬細胞炎性活化，顯著減低炎癥相關因子的基因及分泌蛋白表達，并且可促進IL4誘導的修復型M2巨噬細胞基因的表達以及抗炎因子IL-10小幅度的增高。

本研究顯示，HepLPC可以以旁分泌的形式通過影響巨噬細胞亞群的變化，起到抑制炎癥反應、促進組織修的作用。本實驗主要通過體外巨噬細胞的極化模型為HepLPC進行體內治療應用提供了體外評價模型以及參考依據，不過肝臟病理微環境十分復雜，涉及多種免疫細胞的調節作用，后續可通過動物實驗研究，驗證其對于肝病的治療作用，為廣大肝病患者提供新型的治療手段。