肝癌合并肝硬化脾功能亢進患者的細胞免疫功能研究及臨床意義

賈哲 張珂 黃容海 赫嶸 魯巖 蔣力

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是一種高發病率、高死亡率的惡性腫瘤。盡管肝細胞癌的治療不斷進展，但復發及晚期患者的預后仍不理想。目前已有多種免疫療法應用于肝癌治療，但效果并不理想[1]。腫瘤的免疫反應是由腫瘤組織的抗原性和腫瘤組織的微環境之間的平衡決定的[2]。在中國，肝癌主要是通過慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染的肝炎肝硬化發展而來，往往此類患者因門靜脈高壓同時合并脾大及脾功能亢進。無論病毒性肝炎、肝硬化、脾功能亢進還是腫瘤都共同導致了患者體內的免疫內環境紊亂[3]。本文對此類患者外周血及肝、脾的細胞免疫情況進行了深入研究。

資料與方法

一、研究對象

選擇2018年1月至2019年6月間就診首都醫科大學附屬北京地壇醫院普外科的原發性肝癌同時合并脾功能亢進，同期行肝癌肝部分切除聯合脾切除術的27名患者為研究對象(實驗組)。納入標準為，年齡≤65歲，皆為乙肝肝硬化；肝癌為首次發現，未接受其他任何手術及靶向、免疫等治療；腫瘤為單發，直徑≤5 cm；術前檢查提示脾大，重度脾功能亢進(外周血中紅細胞、白細胞、血小板兩系或三系重度減少)；近期未發生消化道出血，胃鏡檢查未提示食道胃底靜脈的重度曲張，未提示紅色征或藍色征陽性；肝功能Child分級為A-B級，無嚴重心肺腎及代謝性疾病。另選擇同期于我院健康體檢的患者20例抽取外周血作為對照組1，因肝血管瘤行手術治療的患者13例留取正常肝組織為對照組2，因脾外傷行脾切除術的患者7例留取正常脾臟組織作為對照組3。

二、組織標本的獲取

外周血標本檢測：研究組患者于術前及對照組1健康人群留取外周血，并于即刻流式細胞儀測定CD4+T淋巴細胞占總淋巴細胞比例、CD8+T淋巴細胞占總淋巴細胞比例、CD4+T細胞/CD8+T細胞比值。

腫瘤及肝組織標本的獲取：實驗組術中切除肝臟腫瘤標本后，立刻無菌留取腫瘤及瘤旁5 mm外肝組織；對照組2行肝血管瘤切除術后，據血管瘤外5 mm留取肝組織。獲取標本并制作石蠟標本留存，并收集所有標本后統一行免疫組化測定，考察兩組標本中CD4、CD8、TGF-β1、Foxp3、Granzyme B的蛋白表達情況。

脾臟組織標本的獲取：研究組與對照組3術中切除脾臟后，立刻留取完整的脾臟組織標本。獲取脾臟組織標本后，同樣制作石蠟標本留存，并收集所有標本后統一行免疫組化測定，考察兩組標本中CD4、CD8、TGF-β1、Foxp3、Granzyme B的蛋白表達情況。

三、實驗方法

(一)流式細胞術 實驗組及對照組1的患者分別進行外周血樣采集。采用FACS CantoII流式細胞儀(美國BD 公司)及熒光標記的單克隆抗體FITC anti-human CD4、APC anti-human CD8(美國BioLegend公司)對各血樣中的淋巴細胞亞群進行檢測，其中淋巴細胞亞群檢測指標包括CD4+、CD8+，提取數據后計算CD4+/CD8+比值，并比較組間淋巴細胞亞群情況。

(二)免疫組化 免疫組化檢測肝、脾石蠟樣本中CD4、CD8、TGF-β1、Foxp3、Granzyme B的蛋白表達情況。一抗使用TGF-β抗體(Abcam，ab215715；1:500)、Foxp3抗體(Abcam，ab22510；1:500)、Granzyme B抗體(Abcam ab134993；1:250)、CD4抗體 Abcam(ab133616；1:5000)、CD8抗體 (Abcam ab93278；1:1000)；二抗選擇抗鼠/兔通用型免疫組化檢測試劑盒(Proteintech,KIHC-5)。

四、統計學分析

流式細胞檢測結果以CellQuest軟件分析。免疫組化切片用奧林巴斯自動顯微照相裝置進行圖像采集，每張切片隨機拍攝5個高倍鏡(10×40)視野，取5個視野的平均值加以比較；采用Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件測量蛋白陽性表達的累積光密度(integrated optical density，IOD)及平均光密度(average optical density,AOD)進行比較。統計分析采用SPSS 20.0軟件。對于兩獨立樣本間的比較，先行正態性檢驗和方差齊性檢驗，符合正態分布且方差齊性的數據，采用t檢驗比較連續變量間的差異，相應數據以均值±標準差表示；對不符合的數據，采用Mann-WhitneyU檢驗進行比較，相應數據以中位數(極差)表示。

結 果

一、患者基本情況

表1總結了首都醫科大學附屬北京地壇醫院普外科病區2018年1月至2019年6月間收治的27例原發性肝癌同時合并脾功能亢進患者。行肝部分切除術明確腫瘤性質，改善患者生存時間及生存質量；同期行脾切除及賁門周圍血管離斷術目的是治療脾功能亢進引起的白細胞及血小板減少癥，并預防上消化道出血的再次發生。20名健康體檢者為外周血正常情況的對照組1，13名肝血管瘤行手術治療的患者作為正常肝組織的對照組2，11例脾外傷的患者作為正常脾臟組織的對照組3。所有對照組患者均未罹患各類傳染性疾病及肝脾相關疾病。所有樣本均在獲得患者知情同意后進行研究，并獲得了倫理審查委員會的許可。

表1 各組患者的基本情況

二、實驗組及對照組1外周血T淋巴細胞亞群水平的比較

利用流式細胞術，我們測量并比較了實驗組及對照組1外周血T細胞亞群的情況。從圖1可見肝癌合并肝硬化脾亢患者外周血中CD4+T淋巴細胞百分比以及CD4+/CD8+T細胞比例較正常人群明顯下降，但CD8+T淋巴細胞百分比則較正常人群升高。并根據表2結果可見兩組比較具有明顯的統計學差異(P<0.05)。

圖1 實驗組及對照組1外周血采用流式細胞學檢測技術，評估CD4+、CD8+T淋巴細胞情況

表2 實驗組及對照組1外周血T細胞亞群的比較

三、實驗組同正常肝、脾組織免疫狀況的比較

利用免疫組化方法，筆者對肝硬化脾功能亢進合并肝癌患者同健康人群比較，分析此類人群于肝臟及脾臟組織局部的免疫狀況改變。如圖2所示，免疫組化檢測結果顯示Foxp3主要定位于細胞核，染色呈棕黃色。對照組2健康人的肝組織中幾乎沒有Foxp3的表達(IOD值為3 232.150±1 452.071)，而慢性肝炎、肝硬化患者的肝組織中其表達則顯著上升。在肝癌和癌旁的肝組織內的Foxp3表達的T淋巴細胞呈現出彌散分布狀況，而在匯管區的Foxp3表達的T淋巴細胞，鏡下可觀察到明顯的集中分布趨勢，不但平均光密度值明顯增加(圖3，P<0.01)，而且累積光密度IOD值更為明顯增加(15 015.298±5 361.053，P<0.01)，說明Foxp3在細胞內的表達以及可表達Foxp3的細胞明顯增加；在脾臟Foxp3表達主要集中在邊緣區，脾小體周圍及動脈淋巴鞘區亦有少量表達。門靜脈高壓癥脾功能亢進患者脾臟組織中的Foxp3表達量(AOD值為0.257±0.017)比對照組正常脾臟(0.269±0.016)的細胞內表達無明顯變化P>0.05。

圖2 免疫組化檢測兩組患者肝、脾樣本中TGF-β1、Foxp3、Granzyme B 、CD4、CD8的蛋白表達情況

圖3 同健康人群比較，肝硬化肝癌患者肝、脾樣本中TGF-β1、Foxp3、Granzyme B 、CD4、CD8的蛋白表達情況

Granzyme B于免疫組化下以細胞漿內出現棕黃色顆粒狀信號為陽性細胞。由此可見Granzyme B于肝臟內無密集趨勢，均勻散布于正常肝竇、癌組織中，所以筆者以平均光密度值對組織內蛋白表達量的多少加以表示。Granzyme B在肝癌組織中的表達量(AOD值為0.075±0.015)高于癌旁(0.059±0.014)及正常肝組織(0.058±0.032)，P<0.05。于癌旁及正常肝組織內表達量無明顯差異；在脾臟Granzyme B廣泛表達于邊緣區及紅髓，于脾功能亢進時Granzyme B 在脾臟的AOD為0.119±0.034，較正常脾臟組織(0.084±0.027)表達明顯增多(P<0.01)。

TGF-β1主要表達于細胞質中，細胞核中也可見少量表達。其染色為棕褐色的為陽性細胞。在免疫組織化學實驗結果可見TGF-β1蛋白在肝癌組織中(AOD值為0.074± 0.017)存在要少于癌旁肝組織(0.084±0.011)及正常肝臟組織(0.091±0.023)；在脾臟TGF-β1分布情況基本同Granzyme B，正常脾臟表達TGF-β1蛋白的AOD值為0.083±0.012，也是于脾功能亢進時明顯增多(0.094±0.016)。

CD4+、CD8+T淋巴細胞在肝臟中主要表達于匯管區，于肝臟組織內基本沒有表達。與正常肝臟相比，肝硬化肝癌患者腫瘤及癌旁CD4蛋白表達的平均光密度值無明顯差異，但可見正常肝臟的累積光密度值IOD(1192.511±348.434)較肝癌組織(36.574±21.262)存在非常明顯的差異(P<0.01)，說明CD4+細胞的數量在正常肝組織要明顯多于肝癌及癌旁組織。同樣，與正常肝臟相比，肝硬化肝癌患者腫瘤及癌旁CD8蛋白表達的平均光密度值及累計光密度值均明顯升高(P<0.05)；在脾臟T淋巴細胞主要分布于脾臟白髓的動脈周圍淋巴鞘以及白髓、紅髓交界處的邊緣區。正常及脾功能亢進時患者脾臟內CD4蛋白表達的平均光密度值基本相同，但累積光密度表現為脾亢下脾臟內CD4+細胞數量明顯下降(正常脾IOD值2 370.48±1 127.28，脾亢下IOD值430.09±166.84)。

討 論

肝細胞肝癌仍是人類最致命、最常見的癌癥之一。乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、酒精、糖尿病等不同病因導致肝損傷，繼而發生炎癥、壞死和肝細胞增生。這種持續性的再生過程最終導致肝硬化，并最終發展為肝癌[4]。肝癌的免疫應答是由腫瘤的抗原性和腫瘤組織的免疫微環境之間的平衡所決定的[5]。前者歸因于癌細胞中細胞信號突變和轉導的累積。另一方面肝臟本身處于一種獨特的免疫微環境，肝臟中免疫細胞、非免疫細胞、以及與免疫有關的遺傳因素和環境因素也會影響對癌癥的免疫應答[7]。因此，從癌組織、癌旁組織、脾臟及外周血等方面對肝癌的免疫內環境進行綜合分析，對肝癌預后評估及個體化免疫治療的發展具有重要意義。

我國肝硬化肝癌的患者往往同時伴有脾功能亢進。正常情況下，脾臟作為人體最大的淋巴器官之一，含有抗原呈遞細胞(APCs)和B、T淋巴細胞，在脾臟血液循環中的抗原可被捕獲并呈遞給脾臟中的T淋巴細胞。脾臟的存在和完整性是免疫微環境的基礎。但在肝硬化門靜脈高壓，脾大脾功能亢進時，患者機體處于一種以細胞免疫為主的免疫功能低下的全身反應性病理狀態[8]。此時脾臟瘀血腫大，血流慢、缺氧，導致其免疫細胞的功能和形態的改變，使巨脾的輔助性T細胞減少，從而導致免疫功能降低。

作為調節性T淋巴細胞(Treg)的特征性標志，Foxp3是控制Treg發育和功能所需要的關鍵調節因子，其水平可反映Treg的數量和功能狀態。Foxp3的缺失或過度表達均可使得Treg細胞的數量或功能發生異常，影響患者免疫功能。在本研究的實驗中，筆者觀察到在肝癌和癌旁的肝組織內的Foxp3表達的T淋巴細胞呈現出彌散分布狀況，而在匯管區的Foxp3表達的T淋巴細胞，鏡下可觀察到明顯的集中分布趨勢。門靜脈高壓癥脾功能亢進患者脾臟組織中的FOXP3表達量比對照組正常脾臟的表達明顯提高；Granzyme B在肝癌及癌旁組織中的表達數量高于肝硬化和正常肝組織。這說明在腫瘤及癌旁組織中，活化的CTL和NK細胞數量明顯增多，局部細胞免疫狀態良好，這與腫瘤抗原的刺激有關。癌旁組織中 Granzyme B細胞數量高于癌組織可能是因為癌組織中伴有一些壞死組織，從而影響了Granzyme B的表達[9]；TGF-β1可促進腫瘤血管的形成，使腫瘤生長加速，也能促進細胞外基質的形成并抑制其降解，增加某些蛋白酶的活性，使基質蛋白降解速度加快，提高活性，降低黏著性，增加腫瘤的浸潤和轉移能力[10]。實驗可見TGF-β1蛋白在肝癌組織中存在要少于癌旁正常肝組織及正常肝臟組織。另外，許多研究都探討了腫瘤、Treg與TGF-β1的關系，表明TGF-β1在肝癌組織中的表達與Treg呈正相關。高Treg細胞浸潤的HCC組織5年生存率明顯低于Treg細胞浸潤的HCC組織[11]。

輔助性T淋巴細胞的主要表面標志物是CD4，在免疫反應中扮演中間過程的角色，調控T淋巴細胞或輔助其他淋巴細胞發揮功能。CD4+T淋巴細胞主要是輔助性T淋巴細胞，通過釋放細胞因子參與抗腫瘤免疫效應[12]；細胞毒性T淋巴細胞的主要表面標志物是CD8，針對HBV抗原的CD8+特異性細胞毒性T淋巴細胞通過分泌抗病毒細胞因子，在清除病毒中起重要作用，被認為是病毒性肝炎發病免疫學的主要效應細胞。CD8+T細胞可對靶細胞產生細胞介導的細胞毒作用 ，同時對CD4+T細胞有調節性抑制作用[13]。CD4/CD8比值可反映機體細胞的免疫功能，為衡量細胞免疫功能狀態的標志之一。正常人群中，CD4+/CD8+是動態平衡的狀態，反映機體處于免疫平衡[14]。在筆者實驗中觀察的結果，同既往實驗一致，當發生惡性腫瘤如HCC時，患者體內無論外周血，還是肝、脾的CD4+T 細胞水平下降而CD8+T 細胞上升，CD4+/CD8+比例失衡，逃避了機體免疫監視，促進了腫瘤發生發展。

根據既往研究，在肝癌的各個階段，無論單藥還是聯合治療，免疫治療藥物均具有合理性及潛在優勢，并且越來越多的證據支持在腫瘤的發展過程中應盡早使用免疫治療。因為免疫藥物起效需要建立在相對健康的免疫系統上。肝癌患者免疫功能失調，且對于同時存在肝硬化脾功能亢進的患者，這種免疫失調尤為明顯。因此在肝癌患者術后，免疫功能恢復時盡早開始相關的免疫治療，可能對肝癌患者的預后會起到關鍵作用。這將是解決肝癌術后低生存率研究工作的重要方向。