茶輪斑病病原菌鑒定及其對茶皂素和茶多酚的敏感性

姚玉仙，張明澤，劉 榮，陳 志，江 榮，韋 梅，高雪靜

（黔南民族師范學院生物科學與農學院，貴州 都勻 558000）

茶輪斑病（tea grey blight）是一種半知菌亞門擬盤多毛孢屬（Pestalotiopsis）病原菌，主要危害茶樹（Camellia sinensis）成葉和老葉，也可危害嫩葉和茶梢，引起葉片枯萎脫落，甚至整株死亡，已成為茶樹的主要病害之一[1-2]。茶輪斑病在世界各產茶區均有發現，我國產茶各省發生均較普遍。近年來，國內茶葉種植面積不斷擴大，規模化程度不斷提高，冬季氣溫回暖現象多有發生，致使茶輪斑病發生范圍擴大、發生程度加重，嚴重影響茶葉產量和品質[3]。目前，防治茶樹病害常用的化學殺菌劑均不同程度地存在有毒性、污染環境及易引起抗藥性等問題[4]，而且一些有機茶園對化學農藥要求較高。加上消費者對茶葉質量安全尤其對茶葉農藥殘留越發關注[5]，發達國家或地區逐步提高的茶葉農藥殘留限量標準成為我國茶葉出口的瓶頸，嚴重阻礙了茶葉貿易的發展[6]。植物源農藥不會造成環境污染，不易使病菌產生抗藥性，利用植物源農藥防治茶樹病蟲害更能保障茶葉的質量安全。茶皂素（teasaponin）又名茶皂甙，是一類齊墩果烷型五環三萜類皂甙的混合物。茶多酚（tea polyphenols）又名茶單寧，是一類從茶葉中提取出來的多羥基酚類混合物。茶皂素[7]和茶多酚[8]都是一種新型的天然抑菌劑，作為一種綠色植物源病原菌防治藥物，具有極大的開發潛力[9]。因此，筆者采用分子生物學方法鑒定病原菌，并測定茶皂素和茶多酚對該病原菌的抑制效果，以期為茶輪斑病的防治提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

樣品采集：于貴州省都勻市紅敏茶園采集具有典型茶樹輪斑病癥狀的樣品。

供試藥劑：茶皂素（純度為20%～40%）和茶多酚（純度為95%）均購買于阿拉丁試劑（上海）有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 茶輪斑病病原菌的分離與純化 采用組織分離法分離病原菌，將采集的茶樹葉片用無菌水沖洗，用滅菌解剖刀在病、健交界處切下3.5 mm × 3.5 mm的帶病組織塊作為分離材料，再用75%乙醇消毒5 s，無菌水沖洗3次后接種至PDA培養基，放入27℃恒溫培養箱中培養，3 d后挑取菌落邊緣的菌絲進行純化，純化后的菌株（DYHM-LB1）轉至PDA斜面培養基培養后保菌。

1.2.2 茶輪斑病病原菌的分子生物學鑒定 采用CTAB法提取病原菌的總DNA，以ITS1（5'-TCCGTAG GTGAACCTGCGG-3'）及ITS4（5'-TCCTCCGCTTATT GATATGC-3'）為引物對茶輪斑病rDNA的ITS區進行PCR擴展，擴增產物回收純化后送上海生工公司測序，將測序結果在NCBI網站上進行Blastn同源性比對，分析并確定其分類地位。采用Clustalx1.83和MEGA7進行聚類分析并構建NJ進化樹，基因的系統發育樹分析方法選擇 Bootstrap method，重復次數為1000。

1.2.3 茶皂素和茶多酚對病原菌生長的抑制性測定

采用菌絲生長速率法測定茶皂素和茶多酚對病原菌菌絲生長的抑制活性。茶皂素和茶多酚均設置5個濃度，分別取不同濃度的茶皂素、茶多酚1 mL加到冷卻至50℃左右的49 mL PDA培養基中，搖勻后倒入3個直徑為90 mm的滅菌培養皿內（3次重復），使茶皂素終濃度分別為4、10、20、50、100 g/L，茶多酚終濃度分別為1、2、5、10、20 g/L，以添加1 mL無菌水的PDA培養基所倒平板為對照。待平板冷卻后，在平板中央放置已純化鑒定的茶輪斑病菌餅（直徑為0.55 cm），27℃恒溫培養。用十字交叉法測量菌落直徑，按公式計算菌絲生長抑制率。

菌絲生長抑制率（%）=（對照菌落直徑-處理菌落直徑）×100/（對照菌落直徑-0.55）

1.2.4 毒力回歸方程和EC50計算 以對照接近長滿平板當天的菌落直徑計算茶皂素和茶多酚不同濃度抑制作用的毒力回歸方程，采用SPSS Statistics 26軟件開展毒力回歸方程的模擬和EC50的計算[10-11]。回歸概率分析中以抑菌直徑（對照菌落直徑-處理菌落直徑）為響應頻率（S）、對照菌落直徑（減去接種菌餅直徑0.55 cm）為實測值總數（T）、濃度為協變量（C），轉換（N）是以10為底的對數，參數估算值中的“PROBIT模型”即為不同抑菌物質的毒力回歸方程，采用卡方（x2）對回歸方程的擬合度進行檢驗。

2 結果與分析

2.1 茶輪斑病病原菌的分離與純化

利用PDA培養基27℃恒溫培養分離純化茶輪斑病病原菌，得到純化菌株DYHM-LB1（圖1），菌落呈紋狀，大致呈圓形，邊緣稍有不規則，菌絲為白色，背面呈淡黃色。

圖1 菌株DYHM-LB1的菌落形態

2.2 茶輪斑病病原菌的分子生物學鑒定

序列比對發現菌株DYHM-LB1與李應祥等[12]發現的都勻市茶輪斑病病原菌序列的Query Cover為99%，Per.Ident為94.85%，而與P. theae（AY924274.1）及Pseudopestalotiopsis theae（HQ832793.1）的Query Cover均為100%，Per.Ident均為94.88%，與Neopestalotiopsis formicarum（LC521861.1）、Neopestalotiopsissp.（MN 337279.1）及Pseudopestalotiopsis sydowiana（MN856236.1）序列的Query Cover為100%，Per.Ident為99.77%。系統發育樹顯示菌株DYHM-LB1與3株擬盤多毛孢菌（LC521861.1、MN337279.1和MN856236.1）聚為同一分支（圖2）。因此，將菌株DYHM-LB1初步鑒定為擬盤多毛孢屬真菌。

圖2 基于ITS序列茶輪斑病病原菌系統發育樹

2.3 茶皂素和茶多酚對病原菌生長的抑制性測定

2.3.1 茶皂素和茶多酚對茶輪斑病的抑制效果 由圖3和圖4可知，添加不同濃度茶皂素及茶多酚的試驗組均呈現出抑菌效果，其抑菌效果隨接種后天數及添加濃度的變化而變化，其中添加不同濃度茶皂素的試驗組抑制率隨接種后天數的增加總體呈上升趨勢，而添加不同濃度茶多酚的試驗組抑制率隨接種后天數的增加總體呈下降趨勢，試驗組抑制效果均隨茶皂素和茶多酚濃度的增加而總體呈增強趨勢。茶皂素對茶輪斑病的抑制效果具有緩效性，而茶多酚的抑制效果具有速效性。

圖3 接種后1～6 d不同濃度茶皂素對茶輪斑病的抑制率

圖4 接種后1～5 d不同濃度茶多酚對茶輪斑病的抑制率

根據接種后每天抑菌率計算添加不同濃度茶皂素和茶多酚的平均日抑制率。由圖5可知，茶皂素濃度在4～50 g/L時平均日抑制率變化不大，在濃度達到100 g/L時平均日抑制率才有明顯升高；由圖6可知，不同濃度茶多酚平均日抑制率隨添加濃度的增加而增加。

圖5 不同濃度茶皂素對茶輪斑病的平均日抑制率

圖6 不同濃度茶多酚對茶輪斑病的平均日抑制率

2.3.2 茶皂素和茶多酚對茶輪斑病毒力回歸方程分析以對照菌絲接近長滿平板時的菌落直徑計算茶皂素和茶多酚不同濃度抑制作用的毒力回歸方程，采用卡方檢驗（x2）驗證回歸方程的擬合度。由表1可知，x2測定值均小于檢驗的臨界值7.815（x20.05，自由度為3），且P值均大于0.05，表明實際測定結果與理論測定結果差異不顯著，卡方（x2）檢驗結果表明毒力回歸方程擬合度良好。EC50反映了藥物對供試病原菌的抑制能力，EC50值越低，表明藥物抑菌活性越好，茶皂素抑制茶輪斑病的EC50為0.044 g/L，而茶多酚的EC50為297.397 g/L，表明茶皂素對茶輪斑病的抑制效果顯著高于茶多酚。

表1 茶皂素和茶多酚對茶輪斑病的毒力

3 討 論

茶輪斑病是目前我國茶園中發生相當普遍的病害之一，主要是由茶擬盤多毛孢侵染發病，關于該病的病原菌一直有不同的報道[13]，可能與擬盤多毛孢屬的劃分標準不同有關，Maharachchikumbura等[14]依據rDNA-ITS、β-tub和EF-1α基因序列對擬盤多毛孢屬的分類進行了修訂，并從此屬中劃分出了新擬盤多毛孢和假擬盤多毛孢2個屬。李應祥等[12]鑒定貴州都勻茶區茶輪斑病的病原菌為茶擬盤多毛孢菌（P. theae），李冬雪等[15]將貴州惠水茶區茶輪斑病的病原菌GZHS-2017-01鑒定為茶假擬盤多毛孢（Ps.camelliae-sinensis），筆者的研究中的菌株DYHM-LB1經序列比對和聚類分析初步鑒定為擬盤多毛孢屬真菌，但該菌株序列與都勻茶區茶輪斑病病原菌[12]、P.theae（AY924274.1）和N. formicarum（LC521861.1）等菌株的序列相似性存在差異，這可能與菌株生長的地域、環境和寄主等因素有關[15]。

黃繼光等[16]研究發現茶皂素對12種植物病原菌有良好的抑菌活性，筆者的研究顯示茶皂素對茶輪斑病也有較好的抑制效果，且抑制效果具有緩效性。茶皂素和茶多酚對茶輪斑病均有抑制作用，茶皂素的抑制效果顯著高于茶多酚，這與鄒東霞等[17]關于茶皂素和茶多酚對八角炭疽病菌均有抑制作用，但茶皂素的抑制作用強于茶多酚的研究結果相類似。茶皂素的抑菌作用強于茶多酚，這可能與茶皂素和茶多酚對病原菌抑菌的作用機理不同有關。張慧勤[18]研究發現茶皂素通過破壞細胞膜的通透性，影響膜上和胞內相關酶的活性，促進膜上蛋白質酶和幾丁質酶加速分解蛋白質和幾丁質，導致細胞壁的完整性被破壞而起到抑菌作用。張新富[19]用油茶皂苷處理玉米小斑病菌菌絲，發現其頂端及中部細胞膨大呈泡囊狀，阻礙了菌絲的生長。李柯欣[20]研究發現茶多酚對細菌表現出極強的抑制作用，而對酵母和霉菌等真菌的抑制作用不明顯，茶多酚是通過抑制細菌的蛋白酶、淀粉酶和水解酶等酶類活性，導致細菌不能從外界分解、攝取蛋白質及碳水化合物而發揮抑菌作用，但當微生物所處外界環境中有足夠的氨基酸和葡萄糖時，即使微生物的水解酶類被抑制，其仍不會受到茶多酚的抑制。該研究中茶多酚對茶輪斑病的抑制效果隨接種天數的增加抑制率下降的現象可能與茶多酚的這種抑菌機制有關。茶皂素和茶多酚大田試驗的抑菌效果及不同茶樹株系的茶皂素和茶多酚含量是否會影響其抗病性等有待進一步研究。