湘西呆鯉線粒體全基因組測序及結構特征分析

熊 鋼，彭英海，向先嘉，周先文,，王 佩，曾 丹，胡亞洲，王曉清

（1.湖南生物機電職業技術學院 生態養殖協同創新中心，湖南 長沙 410127；2.湘西土家族苗族自治州畜牧水產事務中心，湖南 吉首 416000；3.湖南農業大學，湖南 長沙 410128）

湘西呆鯉[1]（Cyprinus carpiovar. Xiangxi）是湖南省湘西山區農民在長期的稻田養魚模式中選育出的一個地方鯉魚品種，該魚具有適應性強、抗病力強、魚性溫順、逃逸率低等特點。近年來，湘西土家族苗族自治州畜牧水產事務中心與湖南農業大學動物科學技術學院合作開展了湘西呆鯉品種的繁殖、保種和選育推廣工作，以提高“湘西呆鯉”良種的生產能力和質量水平[2]，為稻田綜合種養技術的發展提供了有力的技術支撐。

線粒體全基因組（mtDNA）具有廣泛的種內和種間多態性，為母性遺傳，親緣關系較近的物種之間的進化比核基因進化速度快，是從分子水平研究種群遺傳學和進化遺傳學的理想對象[3]。而且，脊椎動物線粒體DNA具備結構緊密、無重組、編碼效率高、進化速率快和無組織特異性等特點，廣泛地應用于系統發育、物種分類和群體遺傳進化等領域中[4]。例如：曲憲成等[5]和孫超等[6]以線粒體COI基因為對象分別研究了千島湖細鱗鲴和光滑河藍蛤的遺傳多樣性；頡曉勇等[7]以線粒體Cytb和D-loop基因分析了羅非魚選育群體遺傳結構，胡曉天等[8]則基于線粒體ATP6基因序列研究了30種作物的系統發育。基因測序技術的發展為線粒體全基因組測序提供了更為便捷的方法，例如毛明光等[9]通過二代基因測序技術獲得了太平洋鱈（Gadus macrocephalus）線粒體基因組全序列。基于此，研究擬通過第二代測序技術獲取湘西呆鯉線粒體全基因組序列，并對該線粒體全基因組序列的結構特征進行分析，為進一步研究湘西呆鯉的遺傳進化和分類提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用的湘西呆鯉樣本取自湖南湘西自治州永順縣小溪鄉小溪村。

1.2 線粒體DNA提取

取湘西呆鯉鰭條，采用天澤基因柱式動物DNA提取試劑盒提取湘西呆鯉總DNA。總DNA用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，-20℃保存備用。

1.3 線粒體基因組測序

DNA樣品檢測合格后，使用Covaris超聲波破碎儀隨機打斷，再經末端修復、加A尾、加測序接頭、純化、PCR擴增等步驟完成整個文庫制備工作，使用Qsep100對文庫的插入片段大小進行檢測，合格后使用Illumina高通量測序平臺（HiSeq X）進行測序。

1.4 基因組組裝和注釋

利用SPAdes v3.11.1（http://cab.spbu.ru/software/spades/）拼接軟件對優化序列進行多個 Kmer參數的拼接，利用MITOS軟件對線粒體基因進行預測，分別計算線粒體全基因組、蛋白編碼基因、rRNA基因的堿基組成。

1.5 基因二級結構預測

使用在線軟件（http://rna.tbi.univie.ac.at ）[10]對線粒體 tRNA的二級結構進行預測。

1.6 系統進化樹構建

為了分析湘西呆鯉的系統發育關系, 以目的基因Blast后從GenBank中下載相關基因序列，使用MEGA 6.0軟件構建進化樹。

2 結果與分析

2.1 湘西呆鯉線粒體基因組結構與特征

研究采用第二代基因測序技術，獲得湘西呆鯉線粒體全基因組序列（基因號：MN544290）, 其長度為16 581 bp。全基因組序列包含了13個蛋白編碼基因（PCGs）、2個rRNA基因和22個tRNA基因（圖1）。H-鏈編碼6個tRNA和ND6基因，L-鏈則編碼其余基因和tRNA，H-鏈和L-鏈的編碼基因與其他鯉魚相同。

圖1 湘西呆鯉線粒體基因組結構

2.2 核苷酸組成

湘西呆鯉線粒體全基因組中堿基含量由高到低依次為：A(31.88%) ＞ C(27.50%) ＞ T(24.86%) ＞ G(15.77%)，A+T含量達到56.74%，明顯高于C+G的含量；以湘西呆鯉線粒體全基因組序列在基因庫Blast分析并下載15種鯉魚線粒體全基因組序列，分析發現15種鯉魚線粒體基因全長在16 576～16 597 bp范圍內；A+T含量在56.65%～57.41%之間，均呈現AT偏向性（表1）；其中A+T含量最多的金魚（Carassius auratus），A+T含量最少的興國紅鯉 （Cyprinus carpio xingguonensis）。

表1 湘西呆鯉及其他物種線粒體基因組堿基組成比較

2.3 湘西呆鯉線粒體基因注釋結果

湘西呆鯉線粒體基因組上的ND6基因在H鏈上編碼蛋白，ND1、ND2、COX1、COX2、ATP8、ATP6、COX3、ND3、ND4L、ND4、ND5和Cytb在L鏈 上編碼蛋白。9個編碼基因終止密碼子為TAG，4個編碼基因終止密碼子為TAA（表2）。其中在tRNA-Pro和tRNA-Phe之間存在一個927 bp的D-loop序列片段。

線粒體基因組中的非編碼區不參與編碼基因，為可調節線粒體DNA復制和轉錄的片段，主要分布于L-鏈復制起始區和各個tRNA基因之間。根據非編碼區結構組成和分布位置的不同，非編碼區可分為基因間隔序列區和基因序列重疊區。在湘西呆鯉線粒體中共尋找到10處重疊區，序列總長度為50 bp；重疊堿基數最長為17 bp，位于tRNA-Glu基因和Cytb基因之間；重疊堿基數最短的為1 bp（表2）。

2.4 tRNA基因二級結構

對湘西呆鯉線粒體22個tRNA基因的定位以及二級結構進行預測分析，結果表明，22個tRNA基因長度為67～76 bp，平均長度為71.09 bp；最短的基因是tRNA-Cys，最長的基因是tRNA-Leu和tRNA-Lys，均為76 bp。tRNA二級結構預測結果顯示，tRNAGlu、tRNA-Lys、tRNA-Ser、tRNA-Met、tRNA-Thr、tRNA-Trp和tRNA-His等22個tRNA基因形成的三葉草結構，其中“環”結構長度為7～16 bp，“莖”結構長度為3～7 bp，如圖2所示。

圖2 部分tRNA二級結構預測圖

2.5 同源性分析

對線粒體全長基因組進行同源性分析發現，16種鯉魚的同源性在89.4%～99.8%之間；興國紅鯉與錦鯉、興國紅鯉與荷包紅鯉、荷包紅鯉與錦鯉、彩鯉與珠江鯉之間的同源性最大，均為99.8%，湘西呆鯉與Labeo catla的同源性最小，為89.4%（表3）。以D-loop區進行同源性分析，結果如表4所示，湘西呆鯉與15種鯉魚之間的D-loop區同源性在87.3%～98.8%之間，而線粒體全長基因同源性在89.4%～99.5%之間；大眼鯉與烏原鯉的線粒體全長基因同源性為98.0%，二者的D-loop區同源性為97.9%，除此之外，其他15種鯉魚之間的線粒體全長基因同源性與D-loop區同源性均相同。

表3 基于線粒體全長基因組同源性 （%）

表4 基于D-loop片段序列同源性 （%）

以線粒體上D-loop序列，采用NJ（Neighborjoining）法構建16種魚類的系統進化樹，如圖3所示，彩鯉、烏原鯉、興國紅鯉、荷包紅鯉、大眼鯉和金魚聚成一大簇，建鯉和桂林鯉、尖鰭鯉和甌江鯉魚、珠江鯉和三角鯉、錦鯉和三倍體鯉分別成簇，湘西呆鯉和L. catla（分布于印度一種鯉魚）都單獨成枝，湘西呆鯉與L. catla獨立于各簇之外，其中湘西呆鯉與錦鯉和三倍體鯉一簇更為鄰近。

圖3 基于D-loop片段序列構建的NJ進化樹

3 結論與討論

目前，現生魚類中最大的科是鯉科，大約包括210屬2 100種，分布于歐亞大陸、東印度群島、北美和非洲，在東亞大陸最為豐富，我國有122屬600多種[11]。在魚類分類中，傳統的形態學對性狀的數據處理分析中，主要利用數理統計分析軟件進行形態學數據的聚類分析，隨著現代分子生物學技術的發展，分子群體遺傳學數據分析方法和處理軟件應運而生[12]。例如王成輝等[13]用限制性內切酶對4種紅鯉的線粒體DNA（mtDNA）進行限制性片段長度多態性（RFLP）分析，在此基礎上推算了各種紅鯉的起源和分化時間。

基因進化的速率受選擇（selection）和突變（mutation）的影響[14]。魚類的線粒體基因組同其他脊椎動物一樣極為保守[15]。線粒體基因組各區域承擔不同的功能，在進化中受到不同強度的選擇壓力，因而其進化速率和系統發育信息也存在差異[16]。毛明光等[9]以鱈形目下幾種鱈為研究對象，以品種間線粒體基因組全序列和Cytb基因構建的進化樹就存在一定差異。潘賢輝等[17]分別以線粒體D-loop區和COI基因分析全州禾花鯉（Quanzhou Procypris merus）、融水禾花鯉（Rongshui P. merus）和野生鯉魚群體的遺傳多樣性和系統進化關系，結果也存在差異。筆者的研究也發現，以線粒體基因組全序列與D-loop片段序列分析湘西呆鯉與其他15種鯉魚之間的同源性和進化樹，其結果存在一定差異。

線粒體全基因組的進化速度比核基因快[3]，而線粒體全基因組上的D-loop片段序列則比線粒體全基因組進化更快。因此，該研究在分析線粒體全基因組和D-loop片段序列同源性基礎上，采用D-loop片段序列構建的系統發育樹更能從分子角度呈現出湘西呆鯉的系統進化關系。