睪丸支持細胞發育與血睪屏障形成的微觀結構

鄭 鵬，馮 瑞，秦 雪，李 琦，王春安

（1.東北農業大學動物科學技術學院，哈爾濱 150030；2.黑龍江昇太牧業發展有限公司，黑龍江蘭西 151500）

睪丸曲細精管是雄性動物產生配子（精子）的器官，在曲細精管內主要有支持細胞和生殖細胞組成［1-2］。在動物生長發育過程中，支持細胞逐漸發育成熟，形成血睪屏障，使曲細精管內維持一個精子發生的特殊內環境，生殖細胞逐漸分化形成生殖干細胞、不同類型的精原細胞、初級精母細胞、次級精母細胞、精細胞、精子［3-4］。初情期后，曲細精管內的結構和功能已經基本完善，生精上皮處于不同發育階段的生精細胞不斷分裂，源源不斷產生精子。但初情期前，支持細胞形成血睪屏障和生殖干細胞的遷移、增殖與分化的機制還不是很清楚。

為此，本試驗選取不同日齡的民豬睪丸，通過制作組織學切片和免疫熒光染色，研究支持細胞發育和血睪屏障形成的形態學變化，為豬睪丸生殖生理的研究和應用提供理論和實踐依據，同時為民豬公豬保種提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及采樣

7，30，60，70，90，110日齡民豬，來源于黑龍江昇太牧業發展有限公司蘭西縣民豬保種場。豬保定后，用碘酒消毒下腹部，無菌取出雙側睪丸，剪去脂肪墊，用37℃生理鹽水沖洗睪丸。取睪丸組織小塊，迅速放入固定液中固定。固定液包括4%甲醛-PBS和pH值為7.2的2.5%戊二醛。

1.2 光學顯微鏡的組織學觀察與測量

取睪丸組織小塊，迅速放入4%甲醛-PBS固定液中固定，24 h后用紗布包好，編號，按照常規的石蠟切片步驟制作切片［5］，對組織切片進行全切片掃描，然后使用CaseViewer 2.4 RTM切片圖像處理軟件進行觀察及測量。

1.3 電子顯微鏡的組織學觀察

將樣品放入pH值7.2的2.5%戊二醛中固定，并置于4℃冰箱中保存24 h。然后按照常規的電子顯微鏡切片步驟制作切片：PBS沖洗—四氧化鋨固定—PBS沖洗—乙醇逐級脫水—丙酮置換—環氧樹脂浸透—包埋—切片。用ULTRACUT-E型超薄切片機切片，切片厚度為5 000～7 000 nm。用檸檬酸鉛、醋酸雙氧鈾在25℃下對切片染色40 min，用雙蒸水沖洗干凈后放入培養皿中待檢。電鏡切片的觀察與顯微攝影采用Mic H-7650型電子顯微鏡［2-3］。

1.4 免疫熒光染色

將載玻片上的切片用二甲苯及梯度乙醇處理，接著置于0.1 mmol/L的EDTA（pH值9.0）中，88℃處理10 min，以修復抗原。處理好的切片用2%BSA在37℃條件下封閉30 min，每張切片加200μL稀釋到適當濃度的第一抗體（1∶500，兔抗多克隆抗體Connexin-43、Occludin、ZO-1、KRT-18），37℃孵育1 h，PBS洗3次。每張切片加200μL稀釋的第二抗體（1∶200，紅色熒光標記的羊抗兔IgG抗體），室溫孵育40 min，PBS洗3次。熒光顯微鏡下觀察及拍照［6-7］。

2 結果

2.1 民豬睪丸的光鏡組織學觀察

7日齡民豬睪丸：曲細精管直徑為58～60μm，每個切面有20～23個支持細胞、1～3個生殖細胞。支持細胞呈圓形，附著在基膜上，細胞核呈圓形或橢圓形，生殖細胞處于向基膜遷移的狀態，有的生殖細胞已經附著到基膜上，細胞著色較淺，細胞形態明顯大于支持細胞，細胞質偏向基膜生長，見圖1A。30日齡民豬睪丸：曲細精管直徑為62～65μm，每個切面有22～25個支持細胞、4～6個生殖細胞。支持細胞的細胞核呈長橢圓形，有的細胞核位置移向管腔，見圖1B。大部分生殖細胞附著在基膜上，或兩個生殖細胞的細胞質緊密連接在一起。60日齡民豬睪丸：曲細精管直徑為80～90μm，生殖細胞和支持細胞鑲嵌排列，支持細胞的細胞質特別發達，細胞質相連，開始形成血睪屏障。有的部位出現兩層細胞，每個切面有9～11個生殖細胞，見圖1C。70日齡民豬睪丸：曲細精管直徑為90～110μm，出現2～3層的細胞，管腔中央是支持細胞的細胞質，細胞質相連，支持細胞的細胞質邊緣開始出現初級精母細胞，見圖1D。90日齡民豬睪丸：曲細精管直徑為130～150μm，基膜處2～3層細胞排列整齊的，支持細胞的細胞質發達，伸向管腔，細胞質內附著初級精母細胞，有的部位有精細胞，見圖1E。110日齡民豬睪丸：曲細精管直徑為180～210μm，管腔內有多層生殖細胞，并出現精細胞和變形的精子，見圖1F、圖1G。

2.2 生殖細胞遷移到基膜的電鏡觀察

生殖細胞遷移到基膜的過程中，首先是細胞質伸出偽足，進入支持細胞之間的空隙，逐漸附著到基膜上，轉變為生殖干細胞，附著基膜時生殖細胞細胞質內的線粒體特別發達，見圖2A、B，并進行有絲分裂。生殖細胞不斷遷移，占據支持細胞的空間，將支持細胞的細胞核和細胞質擠壓向管腔中心側，伴隨著生殖細胞的分裂，有的支持細胞的細胞核被擠壓在基膜上，見圖2C、圖2D。

圖2 30日齡民豬睪丸生殖細胞遷移到基膜的透射電鏡觀察

2.3 支持細胞發育的電鏡觀察

生殖細胞遷移到基膜后，不斷分裂增殖，占據更多的空間，將支持細胞的細胞核和細胞質推向管腔中心方向或擠壓在基膜，支持細胞之間形成連接，將不同類型的生殖細胞隔離開來，見圖3A。同時，支持細胞的細胞質大面積擴張，細胞質內的線粒體特別發達，見圖3B，隨著生殖細胞的不斷增殖與分裂，生殖細胞數量不斷增多，分別形成精原細胞、精母細胞、精細胞，生殖細胞之間僅剩下支持細胞與支持細胞之間的膜相連，見圖3C、圖3D。在整個曲細精管內，隨著生殖細胞的周期性變化，生殖細胞之間支持細胞的連接呈現不同的變化，形成明顯的血睪屏障結構，見圖3E、圖3F。

圖3 90，110日齡民豬睪丸支持細胞發育的透射電鏡觀察

2.4 免疫熒光染色觀察

7日齡睪丸的免疫熒光染色結果見圖4。圖4顯示：未成熟支持細胞的Connexin-43、Occludin、KRT-18染色結果呈陰性，ZO-1染色結果呈陽性；精原細胞的Connexin-43、Occludin染色結果呈陰性，KRT-18染色結果呈弱陽性，ZO-1染色結果呈陽性；間質細胞的Connexin-43、Occludin、KRT-18、ZO-1染色結果呈陽性。30日齡和7日齡睪丸的免疫熒光染色的鑒定結果一致，未列出。

圖4 7日齡民豬睪丸曲細精管的免疫熒光染色結果

3 討論

支持細胞血睪屏障的形成是維持精子發生的重要內環境［8］。家畜出生后，曲細精管內的支持細胞處于未成熟狀態，均勻生長在基膜上，生殖細胞大部分處于曲細精管中心，屬于性原細胞或生殖干細胞，之后逐漸向基膜遷移，并附著到基膜上，轉變為精原干細胞。精原干細胞在分裂過程中，還會形成不同類型的A型精原干細胞，然后產生初級精母細胞［3-4］。在精原細胞進行有絲分裂的過程中，支持細胞不斷成熟分化，形成發達的細胞質，細胞質之間形成血睪屏障的結構，保證初級精母細胞減數分裂和精子的形成［9-10］。本試驗采用組織學切片進行觀察，發現生殖干細胞向基膜遷移時利用細胞質向支持細胞的空隙內進行遷移，細胞質具有一定的極性并且此部位的線粒體增多，會進行一系列的生化反應，具體的機制還有待進一步研究。當生殖干細胞遷移結束后，線粒體均勻分布。支持細胞在發育過程中，主要是細胞質的擴張，兩個支持細胞的細胞質之間進行多處連接，平面上呈類似網格狀，立體上多個支持細胞相互連接，各級的生殖細胞能夠穿過支持細胞之間的連接。支持細胞之間的連接構成多個微環境，保證生殖細胞的有絲分裂、減數分裂、精細胞變形等過程，而且能夠吞噬凋亡的細胞、細胞質等。據此推斷曲細精管內支持細胞和生殖細胞的模型結構為種子-土壤模型，即支持細胞的細胞質立體生長，相互連接，形成生殖細胞生長的支撐結構和環境。生殖細胞類似一粒種子，先鉆入支持細胞空隙，然后向基膜運行；同時支持細胞立體生長，把生殖細胞包圍在里面，隨著生殖細胞的分裂，支持細胞的細胞質逐漸向上生長，形成更厚的支持細胞細胞質層。精細胞變形過程中，逐漸長出支持細胞細胞質層，在形成精子后脫離支持細胞細胞質，游離到管腔內，見圖5。R.L.Brinster等［11］通過小鼠腹腔內注射白消安，消除內源性精子發生，制作曲細精管內只有支持細胞的受體鼠模型，組織學結果顯示，曲細精管內支持細胞的細胞質相連，并有許多空泡樣結構，這一結果也證實了支持細胞之間會形成多個連接和腔室，將不同階段的生殖細胞隔離開來。

圖5 曲細精管內的種子-土壤立體模型結構

民豬是中國東北地區的一個古老的地方豬種，具有產仔多、肉質好、抗寒、耐粗飼、繁殖力高、性成熟早的突出優點，是受保護的國家級地方品種。家畜的初情期和精子的產生是相伴發生的事件，初情期的出現又受到品種、營養、飼養條件等因素的影響［12］，飼料營養水平高、環境條件舒適，會促使家畜的初情期提前和曲細精管內精子提前發生。此外，相同條件下不同個體之間也會存在一定差異，導致不同個體的曲細精管內產生精子的時間不一樣［13-14］。在本試驗中即使同一個個體，不同的曲細精管內生殖細胞的增殖分化、產生精子的時間也不一致，這也可能是導致曲細精管內上皮波和源源不斷產生精子的原因。

Connexin-43、Occludin、ZO-1是構成血睪屏障的重要蛋白，KRT-18是未成熟支持細胞的標志物［6-9］。本試驗計劃使用4種抗體染色，觀察血睪屏障形成的形態變化，然而使用Connexin-43、Occludin、KRT-18、ZO-1對7，30日齡民豬睪丸的曲細精管進行免疫熒光染色，結果4種蛋白中沒有支持細胞特異性的染色。Connexin-43、Occludin可能在未成熟支持細胞不表達，KRT-18在未成熟支持細胞沒有染色，在生殖細胞卻呈微弱染色；ZO-1在支持細胞和生殖細胞都著色。說明使用Connexin-43、Occludin、KRT-18、ZO-1染色無法專一性鑒定民豬支持細胞的發育和血睪屏障的形成，因此試驗中沒有繼續對其他日齡的曲細精管進行染色。

4 結論

民豬支持細胞血睪屏障的形成在60～90日齡之間，90日齡之后血睪屏障已經具備了完整的功能，能夠支持精子發生。