筋骨痛消丸HPLC指紋圖譜的建立及其中7個成分的含量測定

孫實 王一方 趙新杰 王昭 張麗 王丹丹 武愛玲 吳曉龍

中圖分類號 R284 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2021）10-1235-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2021.10.13

摘 要 目的：建立筋骨痛消丸的指紋圖譜，并測定其中7個成分的含量。方法：采用高效液相色譜法（HPLC），以Cosmosil 5C18-MS-Ⅱ為色譜柱，以乙腈-0.02%磷酸水溶液為流動相進行梯度洗脫，流速為1.0 mL/min，檢測波長為230 nm，柱溫為25 ℃，進樣量為10 μL。采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012版）》建立10批筋骨痛消丸的HPLC指紋圖譜并進行相似度評價，通過與混合對照品比對指認共有峰;采用同一HPLC法測定所指認共有峰對應成分的含量。結果：10批筋骨痛消丸樣品中共確定共有峰20個，與對照指紋圖譜的相似度均不低于0.980。通過與混合對照品比對，指認化學成分7個，分別為馬錢苷酸、龍膽苦苷、芍藥苷、丹酚酸B、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ和丹參酮ⅡA。上述7個成分檢測質量濃度的線性范圍分別為4.509～45.090、15.090～150.900、14.985～149.850、14.982～149.820、2.967～29.670、1.944～19.440、3.094～30.940 μg/mL（r均大于0.999），檢測限分別為0.060 1、0.161 0、0.399 6、0.159 8、0.031 6、0.051 8、0.082 5 μg/mL，定量限分別為0.200 4、0.503 0、0.999 0、0.399 5、0.079 1、0.259 2、0.412 6 μg/mL;精密度、穩定性（24 h）、重復性試驗的RSD均小于3.0%（n=6）;平均加樣回收率為98.81%～100.28%，RSD為0.20%～1.21%（n=6）。10批樣品中上述成分的含量分別為0.441 0～0.969 4、3.283 4～4.733 4、1.947 7～3.674 9、1.336 6～2.270 9、0.293 2～0.372 1、0.190 2～0.293 9、0.352 8～0.518 8 mg/g。結論：本研究成功建立了筋骨痛消丸的HPLC指紋圖譜和含量測定方法，可用于其質量控制。

關鍵詞 筋骨痛消丸;指紋圖譜;含量測定;高效液相色譜法

Establishment of HPLC Fingerprints and Content Determination of 7 Components of Jingu Tongxiao Pill

SUN Shi1，2，WANG Yifang1，ZHAO Xinjie1，2，WANG Zhao1，ZHANG Li1，WANG Dandan1，WU Ailing1，2，WU Xiaolong1[1. Dept. of Pharmacy， Luoyang Orthopedic Hospital of Henan Province （Orthopedic Hospital of Henan Province）， Henan Luoyang 471003， China; 2. Research and Development Department， Henan Luozheng Pharmaceutical Co.， Ltd.， Henan Luoyang 471013， China]

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To establish the fingerprint of Jingu tongxiao pill， and to determine the contents of 7 components. METHODS： HPLC method was adopted. The determination was performed on Cosmosil 5C18-MS-Ⅱ column with acetonitrile-0.02% phosphoric acid solution as mobile phase （gradient elution） at the flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was 230 nm and the column temperature was set at 25 ℃. The sample size was 10 μL. HPLC fingerprint of 10 batches of Jingu tongxiao pill was established by using Similarity Evaluation System of TCM Chromatographic Fingerprint （2012 edition）， and common peak was identified by comparing with the mixed reference substance. The contents of corresponding components of the identified common peak were determined by the same HPLC method. RESULTS： There were 20 common peaks in HPLC fingerprint of 10 batches of samples， and the similarity with the control fingerprint was not less than 0.980. By comparing with the mixed reference substance， 7 components were identified， which were loganic acid，gentiopicroside，paeoniflorin，salvianolic acid B，cryptotanshinone，tanshinone Ⅰ and tanshinone ⅡA. The linear range of the above 7 components were 4.509-45.090， 15.090-150.900， 14.985-149.850， 14.982-149.820， 2.967-29.670， 1.944-19.440， 3.094-30.940 μg/mL（all r>0.999），respectively. The limits of detection were 0.060 1， 0.161 0， 0.399 6， 0.159 8， 0.031 6， 0.051 8， 0.082 5 μg/mL， respectively. The limits of quantitation were 0.200 4， 0.503 0， 0.999 0， 0.399 5， 0.079 1， 0.259 2， 0.412 6 μg/mL， respectively. RSDs of precision， stability （24 h） and reproducibility tests were all lower than 3.0% （n=6）. Average recoveries were 98.81%-100.28%， RSDs were 0.20%-1.21% （n=6）. In 10 batches of samples， the contents of the above 7 components were 0.441 0-0.969 4，3.283 4-4.733 4，1.947 7-3.674 9，1.336 6-2.270 9，0.293 2-0.372 1，0.190 2-0.293 9 and 0.352 8-0.518 8 mg/g，respectively. CONCLUSIONS： In this study， HPLC fingerprint and content determination method of Jingu tongxiao pill are successfully established and can be used for quality control.

KEYWORDS? ?Jingu tongxiao pill;Fingerprint;Content determination; HPLC

筋骨痛消丸是以國家級非物質文化遺產“平樂郭氏正骨法”經驗方為基礎開發的中藥新藥，為國家中藥保護品種，由11味中藥組成。方中丹參、雞血藤活血化瘀、舒筋止痛，為君藥;香附、烏藥行氣止痛、溫經散寒，為臣藥;桂枝、威靈仙、秦艽溫經通絡、祛風除濕、消腫止痛，白芍、地黃養血斂陰、補虛止痛，川牛膝活血化瘀、通利關節，三味藥材共為佐藥;甘草緩急止痛、調和諸藥，為使藥。全方共奏活血行氣、溫經通絡、消腫止痛之功，臨床上主要用于血瘀寒凝以及骨質增生引起的膝關節疼痛、腫脹、活動受限等癥，療效顯著[1-3]。此外，有臨床研究報道，筋骨痛消丸單用或與其他藥物聯用對肩關節周圍炎、髕骨軟化癥、類風濕性關節炎、腰椎間盤突出癥、膝關節骨壞死等疾病均有明顯的改善作用[4-8]。

目前，國家藥品標準中筋骨痛消丸僅以丹參酮ⅡA作為“含量測定”項下的考察指標[9]。這種以方中藥材所含單一有效成分作為定量指標的方法難以全面控制其內在質量，更無法體現“多成分、多靶點”理論下的中藥整體質量，故有必要探索一種更加全面、相對更能反映中藥整體內涵的質量控制方法。中藥色譜指紋圖譜能夠提供豐富的鑒別信息，其兼顧“整體性”和“模糊性”的特點，非常適合中藥復雜體系的質量控制，是一種國際公認的控制中藥或天然藥材質量的方法[10-12]。基于此，本研究建立了筋骨痛消丸的高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜，通過與對照品比對指認共有峰，測定所指認共有峰對應成分的含量，以期為建立科學、合理的筋骨痛消丸質量控制方法提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括Nexera XR型HPLC儀及配套的LC-20ADXR型二元高壓泵、FCV-11AL型快速流路切換器、DGU-20A5R型脫氣單元、SIL-20AXR型自動進樣器、CTO-20AC型柱溫箱、SPD-M20A型二極管陣列檢測器、Labsolution DB（Ver. 6.70）色譜工作站（日本Shimadzu公司），KH-600DB型數控超聲波清洗器（昆山禾創超聲儀器有限公司），MS204S型萬分之一電子分析天平、AB135-S十萬分之一電子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

筋骨痛消丸（批號201127、201128、201129、201130、201131、201132、201133、201135、201201、201203，編號S1～S10，規格每袋裝6 g）購自河南省洛正藥業有限責任公司;馬錢苷酸對照品（批號111865-201704，純度≥98%）、龍膽苦苷對照品（批號110770-201918，純度≥98%）、丹酚酸B對照品（批號111562-201716，純度≥98%）、丹參酮ⅡA對照品（批號110766-202022，純度≥98%）均購自中國食品藥品檢定研究院;芍藥苷對照品（批號MUST-18032901，純度≥98%）、隱丹參酮對照品（批號MUST-18041115，純度≥98%）、丹參酮Ⅰ對照品（批號MUST-18032207，純度≥98%）均購自成都曼斯特生物科技有限公司;乙腈（色譜純）、甲醇（色譜純）均購自美國TEDIA公司;磷酸（色譜純）、甲酸（色譜純）均購自天津科密歐化學試劑有限公司;其余試劑均為分析純或實驗室常用規格，水為純凈水。

2 方法與結果

2.1 指紋圖譜的建立

2.1.1 色譜條件 以Cosmosil 5C18-MS-Ⅱ（250 mm× 4.6 mm，5 ?m）為色譜柱，以乙腈（A）-0.02%磷酸水溶液（B）為流動相進行梯度洗脫（0～15 min，5%A→12%A;15～35 min，12%A→15%A;35～75 min，15%A→32%A;75～90 min，32%A→60%A;90～130 min，60%A→70%A）;檢測波長為230 nm;流速為1.0 mL/min;柱溫為25 ℃;進樣量為10 μL。

2.1.2 混合對照品溶液的制備 精密稱取馬錢苷酸、龍膽苦苷、芍藥苷、丹酚酸B、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ和丹參酮ⅡA對照品各適量，分別置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容，制成質量濃度分別為0.300 6、0.503 0、0.499 5、0.499 4、0.197 8、0.216 0、0.206 3 mg/mL的單一對照品貯備液。吸取上述單一對照品貯備液適量，用甲醇配制成馬錢苷酸、龍膽苦苷、芍藥苷、丹酚酸B、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ和丹參酮ⅡA質量濃度分別為45.090、150.900、149.850、149.820、29.670、19.440、30.940 μg/mL的混合對照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 取筋骨痛消丸樣品，研磨至細粉，過六號篩（下同）。精密稱取細粉0.4 g，置于150 mL具塞錐形瓶中，精密加入甲醇30 mL，密塞，稱定質量，超聲（頻率45 kHz，功率600 W）提取45 min，放至室溫;再次稱定質量，用甲醇補足減失的質量，搖勻，經0.45 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.1.4 精密度試驗 取“2.1.3”項下供試品溶液（編號S1）適量，按“2.1.1”項下色譜條件連續進樣6次。以丹酚酸B為參照，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果，20個共有峰相對保留時間的RSD為0.02%～0.42%（n=6），相對峰面積的RSD為0.19%～2.91%（n=6），表明本方法精密度良好。

2.1.5 穩定性試驗 取“2.1.3”項下供試品溶液（編號S1）適量，分別于室溫下放置0、3、6、9、12、24 h時按“2.1.1”項下色譜條件連續進樣測定。以丹酚酸B為參照，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果，20個共有峰相對保留時間的RSD為0.04%～0.16%（n=6），相對峰面積的RSD為0.25%～2.93%（n=6），表明供試品溶液于室溫下放置24 h內穩定性良好。

2.1.6 重復性試驗 取筋骨痛消丸樣品（編號S1）約0.4 g，共6份，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定。以丹酚酸B為參照，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果，20個共有峰相對保留時間的RSD為0.09%～0.73%（n=6），相對峰面積的RSD為0.66%～2.85%（n=6），表明本方法重復性良好。

2.1.7 HPLC指紋圖譜的建立 取10批筋骨痛消丸樣品，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。將色譜圖導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012版）》，選取S1樣品色譜圖作為參照，將時間窗設置為0.2 min，經多點校正（3點）后自動匹配，生成HPLC疊加指紋圖譜，采用中位數法生成HPLC對照指紋圖譜（R）詳見圖1、圖2。

2.1.8 相似度評價 采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012版）》對10批筋骨痛消丸樣品進行相似度分析。結果，10批樣品圖譜與對照指紋圖譜間的相似度均不低于0.980，提示不同批次樣品的相似度較高，生產工藝相對穩定，詳見表1。

2.1.9 共有峰指認 由圖2可見，10批筋骨痛消丸樣品共有20個共有峰，通過與混合對照品溶液（圖3A，同一色譜條件下測得）比對，指認共有峰7個，分別為馬錢苷酸（峰5）、龍膽苦苷（峰6）、芍藥苷（峰8）、丹酚酸B（峰14）、隱丹參酮（峰17）、丹參酮Ⅰ（峰18）和丹參酮ⅡA（峰19）。

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件 同“2.1.1”項。

2.2.2 混合對照品溶液的制備 同“2.1.2”項。

2.2.3 供試品溶液的制備 同“2.1.3”項。

2.2.4 陰性對照溶液的制備 按筋骨痛消丸處方組成分別稱取方中藥材，按照制劑工藝分別制得缺秦艽、白芍、丹參的陰性對照樣品，再按“2.1.3”項下方法分別制成缺味藥材陰性對照溶液。

2.2.5 系統適用性試驗 取“2.2.2”項下混合對照品溶液、“2.2.3”項下供試品溶液（編號S1）、“2.2.4”項下陰性對照溶液各適量，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結果，各待測峰與相鄰色譜峰間的分離度均大于1.5，理論板數均不低于10 000，陰性對照溶液對測定均無干擾，詳見圖3。

2.2.6 線性關系考察 精密量取“2.2.2”項下混合對照品溶液1、2、4、6、8、10 mL，分別用甲醇定容至10 mL量瓶中，得不同質量濃度的系列工作溶液。取上述系列工作溶液各適量，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以各待測成分質量濃度為橫坐標（x，μg/mL）、峰面積為縱坐標（y）進行線性回歸，結果見表2。

2.2.7 檢測限與定量限考察 將“2.2.2”項下混合對照品溶液用甲醇逐級稀釋，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，分別以信噪比3 ∶ 1和10 ∶ 1計算檢測限和定量限，結果見表3。

2.2.8 精密度試驗 精密吸取“2.2.6”項下稀釋后的混合對照品溶液（馬錢苷酸、龍膽苦苷、芍藥苷、丹酚酸B、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ和丹參酮ⅡA的質量濃度分別為27.054、90.540、89.910、89.892、17.802、11.664、18.564 μg/mL）各10 μL，按“2.2.1”項下色譜條件連續進樣6次，記錄峰面積。結果，馬錢苷酸、龍膽苦苷、芍藥苷、丹酚酸B、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA峰面積的RSD分別為1.99%、2.15%、1.98%、1.06%、1.17%、1.03%、1.20%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.2.9 穩定性試驗 取“2.2.3”項下同一供試品溶液（編號S1），分別于室溫下放置0、3、6、9、12、24 h時按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，馬錢苷酸、龍膽苦苷、芍藥苷、丹酚酸B、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA峰面積的RSD分別為0.59%、0.28%、0.65%、1.24%、1.35%、0.95%、1.38%（n=6），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內穩定性良好。

2.2.10 重復性試驗 精密稱取同一批筋骨痛消丸樣品（編號S1）6份，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并按標準曲線法計算含量。結果，馬錢苷酸、龍膽苦苷、芍藥苷、丹酚酸B、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA含量的RSD分別為2.71%、1.42%、1.65%、1.78%、0.82%、1.48%、1.25%（n=6），表明該方法重復性良好。

2.2.11 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量的筋骨痛消丸樣品（編號S1）0.2 g，共6份，置于具塞錐形瓶中，分別加入與待測成分近似等量的混合對照品溶液，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率。結果，7個待測成分的平均加樣回收率為98.81%～100.28%，RSD為0.20%～1.21%（n=6），詳見表4。

2.2.12 樣品含量測定 取10批筋骨痛消丸樣品粉末各0.4 g，精密稱定，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并按標準曲線法計算馬錢苷酸、龍膽苦苷、芍藥苷、丹酚酸B、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ和丹參酮ⅡA的含量。每樣品重復測定3次，取平均值，結果見表5。

3 討論

3.1 色譜條件的選擇

3.1.1 檢測波長的選擇 本課題組前期采用二極管陣列檢測器在190～400 nm波長范圍內對待測成分進行掃描。結果顯示，在230 nm波長處色譜圖中的峰容量較多、峰形較好，故本研究選擇230 nm作為最終檢測波長。

3.1.2 流動相的選擇 由于筋骨痛消丸中化學成分眾多、理化性質各異，故本研究采用梯度洗脫的模式，先后考察了甲醇-水、乙腈-水以及甲醇-0.1%甲酸水溶液、乙腈-0.1%甲酸水溶液、乙腈-磷酸水溶液（0.02%～0.1%）的分離效果。結果表明，當流動相為乙腈-磷酸水溶液時，所得色譜圖基線平穩，各色譜峰分離效果相對更好。同時，本課題組對流動相中磷酸的濃度進行了考察，發現不同磷酸濃度（0.02%～0.1%）對分離效果幾乎沒有影響，故最終選擇乙腈-0.02%磷酸水溶液作為流動相。

3.1.3 柱溫的選擇 本課題組前期分別對25、30、35、40 ℃等不同柱溫進行了考察。結果表明，當柱溫為25 ℃時，各待測成分的色譜峰峰形及分離度最好，故本研究柱溫選擇為25 ℃。

3.2 參照峰的選擇

由于丹酚酸B的峰面積較大、保留時間適中，同時與其他色譜峰的分離度較好，故選擇丹酚酸B作為指紋圖譜的參照峰。

3.3 指標性成分的確認

通過與對照品比對，本研究共指認了馬錢苷酸、龍膽苦苷、芍藥苷、丹酚酸B、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ和丹參酮ⅡA共7個成分，分別來自于丹參、白芍和秦艽。這3種藥材是筋骨痛消丸處方中用量較大的組分。同時，指認的7個成分也是2020年版《中國藥典》中上述3種藥材“含量測定”項規定的定量檢測指標，可以說是各藥材的代表性成分[13]。除此之外，有研究表明，這7個成分均有良好的抗炎、鎮痛活性，與筋骨痛消丸發揮其抗骨關節炎作用直接相關[14-16]。因此，選擇這7個成分作為本研究的定量分析指標對筋骨痛消丸的質量控制具有一定的意義。

3.4 指紋圖譜與含量測定結果分析

本研究建立的筋骨痛消丸HPLC指紋圖譜共獲取20個共有峰，通過與混合對照品比對，共指認出其中7個化合物，分別為馬錢苷酸、龍膽苦苷、芍藥苷、丹酚酸B、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ和丹參酮ⅡA。另外，在未指認的色譜峰中，通過與陰性樣品比對，可以得出峰7、8可能來源自白芍，峰13、16可能來源自丹參，具體歸屬有待進一步確認。與此同時，10批筋骨痛消丸樣品圖譜與對照指紋圖譜間的相似度均不低于0.980，說明這10批樣品的成分相似。為進一步考察筋骨痛消丸的質量，本研究建立了這7個成分的含量測定方法，并對10批筋骨痛消丸進行了定量測定。結果發現，雖然圖譜間相似度很高，但不同批次間各成分的含量依然存在較大差異，因此可以考慮將多成分含量測定加入至筋骨痛消丸的質量控制中，以更全面地提高該制劑的質量。

綜上所述，本研究成功建立了筋骨痛消丸的HPLC指紋圖譜和含量測定方法，可用于其質量控制。

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（收稿日期：2021-02-05 修回日期：2021-04-01）

（編輯：鄒麗娟）