染料木素對人鼻咽癌CNE1細胞生長的抑制作用及靶點預測

何文棟 蘇雯清 韋坤華 奎玲 王碩 龔小妹 楊曉男 繆劍華

中圖分類號 R285 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2021）10-1196-09

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2021.10.07

摘 要 目的：研究染料木素對人鼻咽癌CNE1細胞生長的抑制作用并預測其可能的作用靶點。方法：采用CCK-8法檢測0（空白對照）、12.5、25、50、100、150 ?mol/L染料木素分別作用24、48、72 h對CNE1細胞增殖的影響;分別采用流式細胞術檢測0（空白對照）、15、30、60 ?mol/L染料木素作用24 h對CNE1細胞周期、凋亡的影響;采用劃痕實驗檢測0（空白對照）、10、20、30 ?mol/L染料木素作用24 h對CNE1細胞遷移能力的影響。采用高通量測序法挖掘0（空白對照）、30 ?mol/L染料木素作用24 h后CNE1細胞中的差異基因，并通過實時熒光定量-聚合酶鏈式反應法（RT-qPCR）對上述細胞實驗相關差異基因mRNA的表達情況進行驗證。結果：與空白對照比較，12.5、25、50、100、150 ?mol/L染料木素對細胞的增殖均有顯著的抑制作用（P<0.01），且呈濃度-時間-效應趨勢;15、30 ?mol/L染料木素可使細胞周期阻滯于G0/G1期（P<0.05或P<0.01），30、60 ?mol/L染料木素可使細胞周期阻滯于G2/M期并顯著促進其凋亡（P<0.05或P<0.01）;10、20、30 ?mol/L染料木素可顯著抑制細胞的遷移能力（P<0.01）。高通量測序共挖掘出2 271個差異基因（padj<0.05），其中1 154個基因上調、1 117個基因下調;結合細胞實驗結果共篩選出p53、p21、STC2、FGF2、CDK6、CYCLIN D、PI3K、AKT等8個潛在靶點差異基因。經RT-qPCR法驗證，其中p53、p21、STC2、FGF2、CDK6、CYCLIN D、AKT等7個潛在靶點差異基因mRNA的表達均顯著下調（P<0.05），與轉錄組測序結果基本一致。結論：染料木素能有效抑制人鼻咽癌CNE1細胞的生長;其抗鼻咽癌機制可能與抑制突變型p53基因的表達，恢復野生型P53蛋白功能以及抑制磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B通路的活性有關。

關鍵詞 染料木素;人鼻咽癌CNE1細胞;高通量測序;突變型p53基因;磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B通路

Inhibitory Effect and Target Prediction of Genistein on the Growth of Human Nasopharyngeal Carcinoma CNE1 Cells

HE Wendong1，SU Wenqing2，WEI Kunhua3，4，KUI Ling5，WANG Shuo6，GONG Xiaomei6，YANG Xiaonan3，4，MIAO Jianhua1，2，3，4，6（1. Pharmacy College， Guangxi University of TCM， Nanning 530200， China;2. Pharmacy College， Guangxi Medical University， Nanning 530021， China; 3. Guangxi Key Laboratory of Medicinal Resources Protection and Genetic Improvement， Guangxi Botanical Garden of Medicinal Plants， Nanning 530023， China; 4. Guangxi Engineering Research Center of TCM Resource Intelligence Creation， Guangxi Botanical Garden of Medicinal Plants， Nanning 530023， China; 5. Pharmacy College， Jiangsu University， Jiangsu Zhengjiang 212013， China; 6. National Engineering Laboratory of Southwest Endangered Medicinal Resources Development， Guangxi Botanical Garden of Medicinal Plants， Nanning 530023， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To study the inhibitory effects of genistein on the growth of human nasopharyngeal carcinoma. CNE1 cells and predict its potential target. METHODS： CCK-8 method was used to test the effects of 0（blank control）， 12.5， 25， 50， 100， 150 ?mol/L genistein on the proliferation of CNE1 cells after treated for 24， 48， 72 h. Flow cytometry was carried out to detect the effects of 0（blank control）， 15， 30， 60 ?mol/L genistein on the cell cycle and apoptosis of CNE1 cells after treated for 24 h. Scratch test was used to investigate the effects of 0（blank control）， 10， 20， 30 ?mol/L genistein on the migration ability of CNE1 cells after treated for 24 h. High throughput sequencing was conducted to discover the differential genes in CNE1 cells after treated with 0 （blank control）， 30 ?mol/L genistein for 24 h. RT-qPCR assay was adopted to verify the mRNA expression of related differential genes in above trials. RESULTS： Compared with blank control，12.5， 25， 50， 100， 150 ?mol/L genistein showed significant inhibitory effect on the proliferation of CNE1 cells （P<0.01）， in a concentration- time-effect manner;15， 30 ?mol/L genistein could arrest CNE1 cell cycle at G0/G1 stage （P<0.05 or P<0.01）; 30， 60 ?mol/L could arrest CNE1 cell cycle at G2/M stage and promoted cell apoptosis （P<0.05 or P<0.01）. 10， 20， 30 ?mol/L genistein could significantly inhibit the migration ability of CNE1 cells （padj<0.01）. High throughput sequencing revealed a total of 2 271 differentialgenes （P<0.05）， 1 154 of which were up-regulated while 1 117 of which were down-regulated; 8 potential target genes， including p53， p21， STC2， FGF2， CDK6， CYCLIN D， PI3K， AKT， were screened by cell experiment. After validated by RT-qPCR assay， mRNA expression of? p53， p21， STC2， FGF2， CDK6， CYCLIN D and AKT were significantly down-regulated （P<0.05）， which consistent with the sequencing results. CONCLUSIONS： Genistein can effectively inhibit the growth of human nasopharyngeal carcinoma CNE1 cells， the mechanism of which may associated with inhibiting the expression of mutant gene p53， restoring the function of wild-type P53 protein and inhibiting the activity of PI3K/Akt pathway.

KEYWORDS? ?Genistein; Human nasopharyngeal carcinoma CNE1 cells; High throughput sequencing; Mutant gene p53; PI3K/Akt pathway

染料木素又稱染料木黃酮、金雀異黃酮，分子式為C15H10O5，化學名為4′，5，7-三羥基異黃酮，為淡黃至淺褐色粉末，溶于二甲基亞砜和乙醇，是一種天然的異黃酮類化合，存在于千斤拔、淡豆豉、雞血藤等多種天然藥物中，其結構與動物雌激素雌二醇相似，故有植物雌激素之稱[1-3]。現代藥理研究表明，染料木素具有清除自由基、抗氧化、保護心腦血管系統、預防動脈粥樣硬化、防治阿爾茨海默病等多種作用[4-7]。除此之外，染料木素還因具有顯著的抗腫瘤作用而備受關注，如其對乳腺癌、肺癌、肝癌、結腸癌、前列腺癌、口腔癌、喉癌、甲狀腺癌等多種癌癥均有抑制作用[8-15]。

鼻咽癌是發病率最高的頭頸部惡性腫瘤，其發病地區主要集中在我國廣東、廣西、福建等南部地區以及東南亞地區，具有顯著的地域性特征[16]。鼻咽癌的發生主要是因為感染了EB病毒，我國2014年鼻咽癌每十萬人口的發病率和死亡率分別為3.26和1.77，顯著高于世界平均水平[17]。由于鼻咽癌發病部位深，且與眾多重要器官相近，難以手術切除，放、化療依然是鼻咽癌的主要治療手段，但其具有較強的副作用，臨床治療效果有限[18]。據相關研究表明，染料木素對雌、雄大鼠均無生殖毒性，無致畸性，且對子代大鼠生長、發育的毒性較小，安全耐受，是一種安全性較高的抗腫瘤藥物[19-22]。

高通量測序可以準確分析出腫瘤細胞和組織在基因組和轉錄組水平上的基因圖譜，進而為不同癌癥的治療提供更準確的靶點信息[23]。鑒于此，本研究擬以人鼻咽癌CNE1細胞為模型，通過CCK-8實驗、流式細胞術、細胞劃痕實驗等方法考察染料木素對CNE1細胞增殖、細胞周期、凋亡和遷移能力的影響，并與高通量測序相結合，初步考察染料木素抗鼻咽癌的作用及其潛在靶點，再采用實時熒光定量-聚合酶鏈式反應法（RT-qPCR）驗證潛在靶點mRNA的表達情況，為染料木素在抗鼻咽癌領域的進一步研究、利用提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

M200 Pro型多功能酶標儀購自瑞士Tecan公司;GNP-980型恒溫細胞培養箱購自上海精密儀器儀表公司;guava easyCyte型流式細胞儀購自默克化工技術（上海）有限公司;IX73型顯微鏡購自日本Olympus公司;T100型PCR儀購自美國Bio-Rad公司;QuantStudio 3型RT-qPCR儀購自美國Thermo Fisher Scientific公司;BGIDL-50型全自動樣品加載系統、BGISEQ-500RS型基因測序儀均購自深圳華大智造科技股份有限公司。

1.2 主要藥品與試劑

染料木素對照品（批號RFS-R00111812016，純度>98%）購自成都瑞芬思生物科技有限公司;胎牛血清購自美國Thermo Fisher Scientific公司;含0.25%乙二胺四乙酸（EDTA）的胰蛋白酶消化液（批號20181218）購自北京索萊寶科技有限公司;CCK-8試劑盒（批號20200720）購自杭州弗德生物科技有限公司;RPMI 1640培養液、細胞周期檢測試劑盒（批號20201118）、熒光素FITC標記的膜聯蛋白V（Annexin V-FITC）/碘化丙啶（PI）細胞凋亡檢測試劑盒（批號20200610）均購自江蘇凱基生物科技股份有限公司;總RNA提取試劑盒（批號10029777）購自美國BioLabs公司;MGIEasy RNA文庫制備試劑盒（批號A0002）、MGIEasy DNA純化磁珠（批號A0212）和BGISEQ-500RS高通量測序試劑盒（批號A20）均購自深圳華大智造科技股份有限公司;cDNA反轉錄試劑盒（批號N20426）、RT-qPCR反應試劑盒（批號O10318）均購自北京全式金生物技術有限公司;其余試劑均為分析純或實驗室常用規格，水為超純水。

1.3 細胞

人鼻咽癌CNE1細胞（批號CC-Y1118）購自上海酶研生物科技有限公司。

2 方法

2.1 細胞的培養

將CNE1細胞接種于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養液中，置于37 ℃、5%CO2的恒溫培養箱中常規培養（培養條件下同）。每3天傳代1次，每次用含0.25%EDTA的胰蛋白酶消化液消化3 min后，收集細胞繼續培養。待傳至10～20代時，取對數生長期細胞進行后續實驗。

2.2 染料木素對CNE1細胞增殖的影響

采用CCK-8法進行考察。將CNE1細胞用含5%胎牛血清的RPMI 1640培養液制成密度為1×104 mL-1的細胞懸液，按每孔100 μL接種于96孔板中，常規培養。待細胞貼壁后，按照預實驗結果，將其分為空白對照組（0 ?mol/L）和不同濃度染料木素組（12.5、25、50、100、150 ?mol/L），每組設置3個復孔，并另設調零孔。分別于加藥干預24、48、72 h時，在每孔中加入CCK-8溶液10 ?L，繼續培養2 h。使用酶標儀于450 nm波長處測定各孔的吸光度（A），計算細胞的增殖抑制率：增殖抑制率（%）=（實驗組A值-空白對照組A值）/（空白對照組A值-調零孔A值）×100%。使用SPSS 21.0軟件分別計算上述3個時間點的半數抑制濃度（IC50）。實驗重復3次。

2.3 染料木素對CNE1細胞周期的影響

采用流式細胞術進行測定。將CNE1細胞用含5%胎牛血清的RPMI 1640培養液制成密度為1.5×105 mL-1的細胞懸液，按每孔2 mL接種于6孔板中，常規培養。待細胞貼壁后，將其分為空白對照組（0 ?mol/L）和不同濃度染料木素組（15、30、60 ?mol/L，以CCK-8實驗48 h的IC50為中劑量組、1/2倍 IC50為低劑量組、2倍IC50為高劑量組），每組設置3個復孔。加藥干預 24 h后，用含0.25%EDTA的胰蛋白酶消化液消化并收集細胞，按細胞周期檢測試劑盒方法進行固定、染色，然后采用流式細胞儀進行檢測。使用ModFit 5.0軟件進行圖片分析，計算各個周期細胞的比例。實驗重復3次。

2.4 染料木素對CNE1細胞凋亡的影響

采用流式細胞術進行測定。細胞按“2.3”項下方法接種、分組和給藥。加藥干預 24 h后，用含0.25%EDTA的胰蛋白酶消化液消化并收集細胞，按照Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒方法進行染色，然后使用流式細胞儀測定各組細胞的凋亡情況，以Q2、Q3象限細胞所占比例之和為凋亡率。實驗重復3次。

2.5 染料木素對CNE1細胞遷移的影響

采用細胞劃痕實驗進行測定。將CNE1細胞用含5%胎牛血清的RPMI 1640培養液制成密度為4×105 mL-1的細胞懸液，按每孔2 mL接種于6孔板中，常規培養。待細胞貼壁后，將其分為空白對照組（0 ?mol/L）和不同濃度染料木素組（10、20、30 ?mol/L，為避免過高劑量使細胞脫落影響實驗結果準確性，以CCK-8實驗48 h的IC50值為高劑量組、1/2倍IC50為中劑量組、1/3倍IC50為低劑量組）。常規培養至細胞鋪滿培養孔的90%時，在6孔板的后側用標記筆劃3條等距黑線，然后用10 ?L槍頭在培養孔內劃3條平行等距的線垂直于黑線，再給藥干預。分別在加藥干預0、24 h時，每組隨機選取5個點進行拍照。使用Image J 1.48軟件分別測定劃痕面積，取平均值，然后計算傷口愈合率：傷口愈合率（%）=（0 h時的平均劃痕面積-24 h時的平均劃痕面積）/ 0 h時的平均劃痕面積×100%。重復實驗3次。

2.6 染料木素對CNE1細胞中基因表達的影響

將CNE1細胞用含5%胎牛血清的RPMI 1640培養液制成密度為3×105 mL-1的細胞懸液，按每孔2 mL接種于6孔板中，常規培養。待細胞貼壁后，將細胞分為空白對照組和30 ?mol/L染料木素組，每組設置3個復孔。加藥干預24 h后，常規消化、收集細胞。按照總RNA提取試劑盒方法提取細胞中總RNA，并按照MGIEasy RNA文庫制備試劑盒方法對總RNA進行富集、反轉錄、擴增和純化等操作后得到RNA文庫，再對RNA文庫進行均一化、環化、酶切消化和純化后，按照高通量測序試劑盒方法對其進行芯片加載和高通量測序，以得到空白對照組和30 ?mol/L染料木素組細胞中基因的堿基序列（即原始測序數據）。用FastQC 0.11.9軟件對堿基序列數據進行質量控制，用Trimmomatic 0.36軟件去除與接頭匹配率超過30%的測序片段并過濾掉長度低于50 bp的片段后，再用Botie2 2.4.2軟件將質量控制后的數據映射到人類參考基因組上，并計算人類參考基因組中各基因的表達量（記為“Count”值）。利用DESeq2 3.13軟件計算分析各基因表達量的差異倍數的對數值[log2（Fold change）]，且得到對應的padj值（矯正后的P值）， 以log2（Fold change）<0為表達下調，log2（Fold change）>0為表達上調，以log2（Fold change）>1且padj<0.05為標準篩選差異基因，利用R語言包中的ggplot2包繪制差異基因火山圖。結合上述細胞實驗結果，篩選出調控相關過程的8個差異基因以進行后續研究，并采用在線網站Morpheus（https：//software.broadinstitute.org/morpheus/）以log2Count值繪制熱圖。

2.7 差異基因表達的驗證

采用RT-qPCR法進行驗證。按“2.6”項下方法進行細胞培養、給藥、收集和提取細胞中總RNA。將總RNA按cDNA反轉錄試劑盒方法反轉錄成cDNA后，以cDNA為模板使用SYBR Green Ⅰ法進行RT-qPCR反應。RT-qPCR反應體系（共20 ?L）包括cDNA模板1 ?L，上、下游引物（10 ?mol/L）各0.4 ?L，qPCR反應緩沖液（2×）10 ?L，熒光染料（50×）0.4 ?L，無酶水7.8 ?L。反應程序為94 ℃變性5 s，56 ℃退火15 s，72 ℃延伸10 s，共40個循環。以GAPDH為內參基因，采用2-ΔΔCt法計算各目的基因的相對表達量（將空白對照組的值定義為1）。實驗重復3次。引物序列及擴增產物長度見表1（引物序列由本課題組使用Primer 5.0軟件自行設計，由廣州天一輝遠基因科技有限公司合成）。

2.8 統計學方法

采用SPSS 21.0軟件對數據進行統計分析。結果以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 染料木素對CNE1細胞增殖的影響結果

加藥干預24、48、72 h后，與空白對照組比較，12.5、25、50、100、150 ?mol/L染料木素組細胞的增殖抑制率均顯著升高（P<0.01）。在相同濃度染料木素作用下，細胞的增殖抑制率有隨作用時間延長而升高的趨勢;在加藥干預相同時間時，細胞的增殖抑制率有隨染料木素濃度增加而升高的趨勢。藥物作用24、48、72 h時的IC50分別為56.32、34.13、21.90 ?mol/L。可見，染料木素對CNE1細胞的增殖具有明顯的抑制作用，且該作用呈濃度-時間-效應趨勢。不同濃度染料木素作用不同時間后對CNE1細胞增殖的影響結果見表2。

3.2 染料木素對CNE1細胞周期的影響結果

與空白對照組比較，15、30 ?mol/L染料木素組G0/G1期細胞比例顯著升高（P<0.05或P<0.01），但60 ?mol/L染料木素組G0/G1期細胞比例顯著降低（P<0.01）;15、30、60 ?mol/L染料木素組S期細胞比例均顯著降低（P<0.01）;30、60 ?mol/L染料木素組G2/M期細胞比例均顯著升高（P<0.05或P<0.01）。與15 ?mol/L染料木素組比較，30、60 ?mol/L染料木素組G2/M期細胞比例均顯著升高（P<0.05或P<0.01），但60 ?mol/L染料木素組G0/G1期細胞比例顯著降低（P<0.01）;與30 ?mol/L染料木素組比較，60 ?mol/L染料木素組G0/G1細胞比例顯著降低（P<0.01），但G2/M期細胞比例顯著升高（P<0.01）。不同濃度染料木素作用24 h后對CNE1細胞周期分布影響的流式細胞圖見圖1，細胞周期測定結果見表3。

3.3 染料木素對CNE1細胞凋亡的影響

空白對照組和15、30、60 ?mol/L染料木素組細胞的凋亡率分別為（4.37±2.02）%、（13.06±3.96）%、（23.28±6.87）%、（29.41±7.43）%。與空白對照組比較，15、30、60 ?mol/L染料木素組細胞的凋亡率均有不同程度升高，且具有一定的濃度依賴性趨勢，其中30、60 ?mol/L染料木素組細胞的凋亡率顯著升高（P<0.05或P<0.01）。不同濃度染料木素作用24 h后對CNE1凋亡影響的流式細胞圖見圖2。

3.4 染料木素對CNE1細胞遷移能力的影響結果

與空白對照組比較，10、20、30 ?mol/L染料木素組細胞的傷口愈合率均顯著降低（P<0.01）;與10 ?mol/L染料木素組比較，20 ?mol/L染料木素組的傷口愈合率差異無統計學意義（P>0.05），但30 ?mol/L染料木素組的傷口愈合率則顯著降低（P<0.01）;與20 ?mol/L組比較，30 ?mol/L染料木素組的傷口愈合率也顯著降低（P<0.01）。不同濃度染料木素作用24 h后對CNE1細胞遷移能力影響的顯微圖見圖3，傷口愈合率測定結果見圖4。

3.5 染料木素對CNE1細胞中基因表達的影響

經染料木素干預后，產生了眾多差異基因，如圖5A所示（圖中，每個點代表1個基因，灰色代表無顯著變化的基因，紅色代表顯著上調的基因，藍色代表顯著下調的基因，且差異越顯著其離散程度越高）。與空白對照組比較，30 ?mol/L染料木素組細胞中共有2 271個差異基因（padj<0.05），其中有1 154個基因表達顯著上調、 1 117個基因表達顯著下調。結合本研究中相關細胞實驗，篩選出p53、p21、STC2、FGF2、CDK6、CYLIN D、PI3K、AKT等8個相關基因進行后續實驗，這8個基因表達量趨勢如圖5B所示（圖中，從藍色到紅色代表了差異基因表達量從低到高的變化趨勢）。結果顯示，與空白對照組比較，30 ?mol/L染料木素組細胞中上述8個基因的表達均呈下調的趨勢。

3.6 CNE1細胞中8個差異基因mRNA表達情況的驗證結果

與空白對照組比較，30 ?mol/L染料木素組細胞中上述8個差異基因mRNA的相對表達量均有不同程度降低，其中p53、p21、STC2、FGF2、CDK6、CYCLIN D、AKT等7個基因mRNA的相對表達量均顯著降低（P<0.05或P<0.01）。各組細胞中8個差異基因mRNA相對表達量的測定結果見表4。

4 討論

本研究結果顯示，12.5～150 ?mol/L染料木素對CNE1細胞的增殖均有不同程度的抑制作用，10～30 ?mol/L染料木素可以抑制CNE1細胞的遷移，15～60 ?mol/L染料木素可不同程度地促進CNE1細胞凋亡，且可以阻滯細胞周期進程。其中，30 ?mol/L的染料木素可以使CNE1細胞的G0/G1期和G2/M期都發生阻滯;而當染料木素濃度提高到60 ?mol/L時，CNE1細胞則大量阻滯于G2/M期，這可能是由于高濃度的染料木素對CNE1細胞G2/M期相關基因或蛋白的調控作用更加顯著所造成的，但具體的作用過程及機制仍然需要進一步研究。

本研究用30 ?mol/L的染料木素干預CNE1細胞后共獲得2 271個差異基因，并用RT-qPCR法驗證了其中8個基因的mRNA表達與測序結果相符，這8個基因也在染料木素對鼻咽癌CNE1細胞的抑制作用中發揮重要作用。p53基因已被證實在抗腫瘤方面作用明顯，通常過表達的p53基因會通過調控其下游基因的表達，直接或間接參與腫瘤細胞的生長、發展和死亡過程，其主要通過阻滯細胞周期和誘導細胞凋亡而產生抗腫瘤作用[24]。然而，本研究發現，在染料木素干預后的CNE1細胞中，p53基因的表達水平并沒有升高反而顯著降低，因此筆者推測p53基因可能在CNE1細胞中發生了突變。已有研究表明，p53基因突變在人類腫瘤細胞中非常常見，約有50%的人類腫瘤細胞都會發生p53基因突變，30%～50%的頭頸部腫瘤患者細胞中會發生p53基因突變[25-26]。與野生型p53基因不同，突變型p53基因并沒有表現出抗癌的作用，反而會促進腫瘤細胞的生長，加快腫瘤發展進程，表現出了與野生型p53基因完全相反的作用[27-29]。研究表明，野生型P53蛋白可以促進E3型泛素化連接酶MDM2的表達，而后者可使P53蛋白泛素化降解;然而，突變型P53蛋白不會激活MDM2，因此導致突變型P53蛋白積聚于腫瘤細胞內[30]。又有報道證實，抑制突變型p53基因的表達或使突變型P53蛋白與某些小分子結合，使突變型P53蛋白發生穩定折疊而恢復其野生型P53蛋白的功能后，可達到抗腫瘤的目的[31-32]。因此筆者推測，在CNE1細胞中突變型p53基因編碼翻譯的突變型P53蛋白無法激活MDM2，導致其積聚于細胞內難以降解，而染料木素能抑制細胞中突變型p53基因表達，甚至與突變型P53蛋白結合，使突變型P53蛋白發生折疊而恢復了野生型P53蛋白的功能，從而阻滯CNE1細胞周期、誘導其凋亡，最終發揮抗鼻咽癌的作用。而人類正常細胞不表達突變型p53基因[33-34]，這意味著染料木素在抑制突變型p53基因表達的同時不會對正常組織造成嚴重損傷，因此該化合物針對突變型p53基因靶向治療鼻咽癌有望得以實現。

STC2基因是錫鈣素家族的成員，STC2以及其所編碼的錫鈣素2（STC2）蛋白具有調節鈣和磷酸鹽分泌的重要作用[35]。目前，已有研究證實，STC2的異常表達與鼻咽癌患者預后不良存在一定關系[36]。STC2蛋白是人頭頸部鱗狀細胞癌細胞生長、轉移和侵襲的正向調節劑;而成細胞纖維生長因子2（FGF2）作為TGF家族的一員，與腫瘤細胞增殖、遷移和侵襲密切相關;STC2、FGF2蛋白對磷酸化蛋白激酶B（p-Akt）、磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）等PI3K/Akt通路中關鍵蛋白的表達均有正向調節作用，可增強頭頸部鱗狀細胞HNSCC的增殖、侵襲和腫瘤轉移能力[37-40]。而本研究結果表明，染料木素可以顯著抑制CNE1細胞的增殖和遷移，且可以顯著降低CNE1細胞中STC2、FGF2基因的表達，而調控PI3K/Akt通路的關鍵基因AKT、PI3K的表達也有不同程度的下降，因此筆者推測是STC2、FGF2基因表達的下調導致了PI3K/Akt通路活性被抑制。細胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）家族和D型細胞周期蛋白（CYCLIN D）是PI3K/Akt通路的下游蛋白，CDK家族依賴CYCLIN D與其結合才能被激活，從而發揮調控細胞周期、轉錄、生長的作用[41-42]。同時，有研究發現，染料木素可直接與CDK6/CYCLIN D復合物結合，從而直接發揮抗鼻咽癌的作用[43]。本研究已經證實，經染料木素干預后，CNE1細胞中CDK6、CYCLIN D基因表達均顯著下調，細胞周期阻滯于G2/M期，這可能是CDK6基因表達下調直接導致了CDK6激酶的表達水平降低;同時，CYCLIN D基因調控CYCLIN D的表達，使蛋白表達水平降低從而抑制CDK6激酶的活性，導致細胞周期被阻滯、轉錄受阻，最終使CNE1細胞生長受到抑制。因此，染料木素的抗鼻咽癌機制可能與其抑制PI3K/Akt通路活性有關。已有的研究表明，染料木素可以通過調控p21、ART、p15等基因mRNA的表達和凋亡調節劑相關X蛋白、胱天蛋白酶8（Caspase-8）、裂解型胱天蛋白酶9（Cleaved-caspase-9）等蛋白靶點，參與鼻咽癌細胞生長、轉移和發展的過程，已確定染料木素能通過抑制Hedgehog通路活性發揮抗鼻咽癌作用[44-45]。p21可以參與多條信號通路轉導，如P53通路和PI3K/Akt通路，其可正向調控P53通路，負向調控PI3K/Akt通路[46-47]。而本研究結果顯示，p21基因表達量顯著下降，與p53基因表達趨勢相同，提示其可能是受到P53通路的調控。

綜上所述，本研究除了通過體外細胞實驗證實了染料木素抗鼻咽癌的活性外，還通過高通量測序技術和RT-qPCR方法相互印證，挖掘出了p53、STC2、FGF2、AKT、PIK、CDK6和CYCLIN D等抗鼻咽癌的相關靶點，發現染料木素可能通過抑制突變型基因p53的表達，恢復野生型P53蛋白的功能，從而發揮抗鼻咽癌的作用。筆者還在mRNA水平上初步證明了染料木素可以抑制PI3K/Akt通路的活性，從而抑制鼻咽癌的生長、轉移。雖然本研究只涉及了基因水平，仍需蛋白水平和體內實驗的驗證，但本研究依托高通量測序技術挖掘出了新的染料木素抗鼻咽癌靶點和通路，也為該化合物的后續研究以及鼻咽癌的治療提供了理論基礎。

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（收稿日期：2021-02-04 修回日期：2021-03-02）

（編輯：林 靜）