b?FGF、TGF?β1、microRNA?34a與慢性乙型肝炎肝纖維化程度的相關(guān)性

李園園 蘇峰 王艷 欒興龍★

作者單位：1.濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬湖西醫(yī)院消化內(nèi)科，山東，菏澤274000

2.單縣中心醫(yī)院消化內(nèi)科，山東，菏澤274000

慢性乙型肝炎（chronic viral hepatitis B，CHB）主要由乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）長(zhǎng)期感染引起，是世界范圍內(nèi)的重大公共衛(wèi)生問(wèn)題之一。CHB 病程較長(zhǎng)時(shí)可引起患者肝細(xì)胞損傷，并使肝臟出現(xiàn)纖維化甚至肝硬化［1］。肝硬化是誘發(fā)肝癌最常見(jiàn)的原因，相關(guān)研究顯示，通過(guò)對(duì)慢性乙肝患者不同肝纖維化程度進(jìn)行區(qū)分診斷，及時(shí)監(jiān)測(cè)肝纖維化進(jìn)展，進(jìn)行恰當(dāng)?shù)母深A(yù)可使疾病進(jìn)展減緩或穩(wěn)定在一定階段，對(duì)延長(zhǎng)慢性乙肝患者的生存時(shí)間和改善生活質(zhì)量有重要意義［2］。在CHB患者肝細(xì)胞破壞、肝纖維化形成的過(guò)程中堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（basic fibroblast growth factor，b?FGF）和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子?β1（transforming growth factor?β，TGF?β1）的作用逐漸受到關(guān)注［3］。此外，微小RNA（microRNA，miRNA）作為重要的調(diào)控分子，是分子水平上監(jiān)測(cè)疾病進(jìn)展的敏感指標(biāo)［4］。miR?34 家族包含由兩種不同基因編碼的三個(gè)microRNA：miR?34a、miR?34b 和miR?34c。近年來(lái)，miRNA?34 家族在CHB 中的表達(dá)異常為肝纖維化的診斷等提供了新靶點(diǎn)［5］。本研究通過(guò)分析b?FGF、TGF?β1 及microRNA?34a 在CHB 患者中的表達(dá)情況，旨在探討三者聯(lián)合對(duì)肝纖維化診斷、病情評(píng)估的價(jià)值，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 基線資料

選取2018年9月至2020年9月本院收治的180 例CHB 患者作為CHB 組，其中男性92 例，女性88 例，年齡平均（48.52±6.18）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①HbeAg 均為陽(yáng)性并接受肝活檢檢查；②符合《病毒性肝炎防治方案》［6］中慢性乙型肝炎診及《肝纖維化中西醫(yī)結(jié)合診療指南》［7］肝纖維化診斷標(biāo)準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①感染甲型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、人類免疫缺陷病毒引起的肝功能異常；②合并內(nèi)分泌、血液系統(tǒng)疾病及心、腎功能衰竭者；③合并肝癌、脂肪肝等其他類型肝臟疾病；④既往存在肝臟或膽切除術(shù)者；⑤哺乳期或妊娠婦女。依據(jù)肝臟硬度測(cè)量值（liver stillness measurement，LSM）［8］將患者分為輕度肝纖維化組43 例（LSM<9.7 kPa）、中度肝纖維化組78 例（9.7 kPa≤LSM<17.5 kPa）、重度肝纖維化組59 例（LSM≥17.5 kPa）。

同時(shí)選取170 例同期于本院接受健康體檢且結(jié)果正常者作為對(duì)照組，其中男性89 例，女81 例，年齡平均年齡（48.58±6.19）歲。CHB 組、對(duì)照組年齡及性別等基線資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。所有研究對(duì)象均簽署知情同意書(shū)，本研究已獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 檢測(cè)方法

1.2.1 血清b?FGF、TGF?β1 檢測(cè)

抽取所有研究對(duì)象空腹靜脈血3 mL，離心（2 000 r/min，15 min）去除殘余細(xì)胞成分，取上層血清置于-70℃待檢。采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)b?FGF、TGF?β1 水平，試劑盒北京北方生物技術(shù)研究所提供，操作步驟嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)執(zhí)行。

1.2.2 血microRNA?34a 檢測(cè)

血清標(biāo)本收集：清晨空腹抽取所有研究對(duì)象外周靜脈血3 mL 于試管中，靜置20 min 后離心（8 000 r/min，4℃，10 min）去除殘余細(xì)胞成分，取上層血清轉(zhuǎn)移至另一試管中，再次離心（1 300 r/min。4℃，10 min），最后取500 μL 血清轉(zhuǎn)移至無(wú)RNA酶的EP 管中分裝，放入-80℃冰箱保存。采用逆轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)熒光定量?PCR 法檢測(cè)血microRNA?34a 水平。miScript II RT 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自德國(guó)QIAGEN 公司，反應(yīng)體系為：miScriptHispct（5x）4 μL，miScriptNucleics（10x）2 μL，miScript Reverse Transcriptase 2 μL，RNA 模板12 μL。逆轉(zhuǎn)錄條件：37℃60 min，95℃10 min。按照試劑盒進(jìn)行qPCR 反應(yīng)（miScript SYBR Green 試劑盒，德國(guó)QIAGEN 公司），反應(yīng)體系10 μL；預(yù)加熱95℃30 min；變性94℃15 s，退火55℃30 s，延伸70℃30 s，共40 個(gè)循環(huán)。Ct 值為反應(yīng)孔的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定閾值的循環(huán)數(shù)。采用U6 作為內(nèi)參，血清中miRNA?34a 的相對(duì)表達(dá)量為為2?△Ct=CtmiRNA?34a?CtU6。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以（）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間行F檢驗(yàn)；相關(guān)性采用Pearson 分析，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CHB 組與對(duì)照組血清b?FGF、TGF?β1、microRNA?34a 水平比較

CHB 組血清b?FGF、TGF?β1、microRNA?34a 水平高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表1。

表1 CHB 組與對(duì)照組血清b?FGF、TGF?β1、microRNA?34a 水平比較（±s）Table 1 Comparison of serum levels of b?FGF，TGF?β1 and microRNA?34a between CHB group and control group（±s）

表1 CHB 組與對(duì)照組血清b?FGF、TGF?β1、microRNA?34a 水平比較（±s）Table 1 Comparison of serum levels of b?FGF，TGF?β1 and microRNA?34a between CHB group and control group（±s）

組別CHB 組對(duì)照t 值P 值n 180 170--b?FGF（pg/mL）36.90±10.25 13.08±3.52 28.740<0.001 TGF?β1（pg/mL）596.85±123.74 302.52±56.21 28.370<0.001 microRNA?34a 0.95±0.32 0.21±0.05 29.807<0.001

2.2 不同肝纖維化程度患者血清b?FGF、TGF?β1、microRNA?34a 水平比較

不同肝纖維化程度患者b?FGF、TGF?β1、mi?croRNA?34a 水平比較：輕度纖維化組<中度纖維化組<重度纖維化組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表2。

表2 不同肝纖維化程度患者血清b?FGF、TGF?β1、microRNA?34a 水平比較（±s）Table 2 Comparison of serum levels of b?FGF，TGF?β1 and microRNA?34a in patients with different degrees of liver fibrosis（±s）

表2 不同肝纖維化程度患者血清b?FGF、TGF?β1、microRNA?34a 水平比較（±s）Table 2 Comparison of serum levels of b?FGF，TGF?β1 and microRNA?34a in patients with different degrees of liver fibrosis（±s）

注：與輕度肝纖維化組比較，aP<0.05；與中度肝纖維化組比較，bP<0.05。

組別輕度肝纖維化組中度肝纖維化組重度肝纖維化組F 值P 值n 43 78 59--b?FGF（pg/mL）25.81±9.68 34.78±9.75a 43.56±8.51ab 45.30<0.001 TGF?β1（pg/mL）497.36±117.52 558.39±119.80a 632.50±85.72ab 19.58<0.001 microRNA?34a 0.63±0.29 0.84±0.25a 1.12±0.16ab 55.91<0.001

2.3 CHB 患者b?FGF、TGF?β1 及microRNA?34a水平與肝纖維化程度的相關(guān)性分析

CHB 患者b?FGF、TGF?β1 及microRNA?34a 水平與LSM 呈正相關(guān)（P<0.05）。見(jiàn)表3、圖1。

表3 CHB 患者b?FGF、TGF?β1 及microRNA?34a 水平與LSM 的相關(guān)性Table 3 Correlation between the levels of b?FGF，TGF?β1 and microRNA?34a and LSM in CHB patients

圖1 CHB 患者b?FGF、TGF?β1 及microRNA?34a 水平與肝纖維化程度的相關(guān)性分析散點(diǎn)圖Figure 1 Scatter diagram of correlation analysis between b?FGF，TGF?β1 and microRNA?34a levels and liver fibrosis in CHB patients

3 討論

CHB 的危害性在于其可發(fā)展成為嚴(yán)重的肝臟疾病及產(chǎn)生相關(guān)并發(fā)癥，導(dǎo)致慢性乙肝患者的高死亡率［9］。因此，診斷慢性乙肝患者肝纖維化的存在、鑒別肝纖維化的程度，從而實(shí)施合適的治療方法控制或逆轉(zhuǎn)肝纖維化是至關(guān)重要的。

肝穿刺活組織檢查是從組織病理學(xué)的角度診斷肝臟病變，評(píng)估疾病預(yù)后，以及輔助判斷臨床治療決策的可行性及為調(diào)整治療方案提供指導(dǎo)的一種參考方法［10］。然而，肝穿刺活組織作為有創(chuàng)侵入性檢查，實(shí)施的風(fēng)險(xiǎn)性較高；同時(shí)由于取樣量的限制，在評(píng)估肝纖維化程度時(shí)缺乏一定的準(zhǔn)確性。由于肝纖維化作為一個(gè)極其復(fù)雜的動(dòng)態(tài)應(yīng)急反應(yīng)，是多種細(xì)胞、多種因素相互促進(jìn)和制約的結(jié)果，因此一些血清生物化學(xué)指標(biāo)逐漸成為臨床監(jiān)測(cè)手段，并引起廣泛關(guān)注。

b?FGF 是是成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子家族成員之一，主要在調(diào)控細(xì)胞分化、增殖中發(fā)揮作用，肝竇內(nèi)皮細(xì)胞、成肌纖維樣細(xì)胞、血管內(nèi)皮及平滑肌細(xì)胞和肝細(xì)胞是bFGF 分泌的主要場(chǎng)所［11］。b?FGF 在正常肝臟的表達(dá)對(duì)維持肝臟生理功能具有重要作用，主要包括維持血管活性、促進(jìn)組織損傷修復(fù)及激活內(nèi)皮細(xì)胞等。研究發(fā)現(xiàn)，在肝臟疾病的早期階段，由于肝組織發(fā)生微循環(huán)障礙導(dǎo)致b?FGF 合成增加，刺激內(nèi)皮細(xì)胞增生、遷移及分化，促使新血管形成［12］。而在肝病的中后期，b?FGF 在肝血管間隔及肝竇壁表達(dá)逐漸增強(qiáng)，一方面可減少細(xì)胞外基質(zhì)降解所必需的酶，另一方面則抑制蛋白酶活性物質(zhì)，從而導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)堆積，影響機(jī)體的反應(yīng)性［13］。從本研究中可以看出，隨著肝纖維化程度的不斷加重，b?FGF 水平呈上升趨勢(shì)，且CHB患者b?FGF 水平與LSM 呈正相關(guān)關(guān)系，有力地佐證了血清b?FGF 的高表達(dá)可加快CHB 病程，通過(guò)監(jiān)測(cè)b?FGF 水平變化可評(píng)估肝纖維化程度，為臨床治療提供思路。

在肝臟中，TGF?β 主要由非實(shí)質(zhì)細(xì)胞合成，如肌成纖維細(xì)胞等。TGF?β1 可刺激肝星狀細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，從而增加細(xì)胞外基質(zhì)的合成，并且TGF?β1 使肝星狀細(xì)胞活化后肝星狀細(xì)胞又可分泌大量的TGF?β1，造成肝纖維化持續(xù)發(fā)展；同時(shí)TGF?β1 還可上調(diào)Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型膠原表達(dá)，并降低基質(zhì)金屬蛋白酶合成及抑制促進(jìn)纖溶酶原激活物的表達(dá)，降低細(xì)胞外基質(zhì)的降解，從而加速纖維化發(fā)生發(fā)展。本研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)TGF?β1 是一種在肝纖維化發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用細(xì)胞因子。此外，既往文獻(xiàn)顯示，肝炎病毒可通過(guò)免疫病理?yè)p傷直接或間接引起Kupffer細(xì)胞的大量激活、浸潤(rùn)，進(jìn)而增加TGF?β1 的分泌［14］。而大量的TGF?β1 又可刺激貯脂細(xì)胞和其他間質(zhì)細(xì)胞分泌TGF?β1，從而形成惡性循環(huán)。本研究發(fā)現(xiàn)CHB 患者TGF?β1 水平與肝纖維化程度呈正相關(guān)關(guān)系，故對(duì)CHB 患者TGF?β1 水平進(jìn)行監(jiān)測(cè)有助于早期肝纖維化的診斷及肝纖維化程度的判斷。

信號(hào)通路參與肝星狀細(xì)胞凋亡，高表達(dá)的miR?27a 和miR?27b 則可參與肝星狀細(xì)胞活化并與肝臟中脂質(zhì)代謝相關(guān)［15］。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，在博來(lái)霉素誘導(dǎo)的肺纖維化小鼠中，miR?34a 消融處理的小鼠比野生型小鼠的肺纖維化更嚴(yán)重［16］。本研究發(fā)現(xiàn)microRNA?34a 水平與肝纖維化程度呈正相關(guān)關(guān)系，進(jìn)一步提示血漿miR?34a 可作為鑒別慢性乙肝患者不同肝纖維化階段的新候選標(biāo)志物。

綜上所述，b?FGF、TGF?β1 及microRNA?34a表達(dá)與CHB 纖維化程度呈現(xiàn)顯著相關(guān)性，聯(lián)合檢測(cè)三者表達(dá)情況對(duì)CHB 病情和纖維化具有一定的診斷價(jià)值。