TLR9 mRNA表達水平與SLE患者病情及疾病進展的相關性

劉志明 郜苗苗 邵麗麗 朱翠敏 劉秀芬

作者單位：滄州市中心醫院兒科，河北，滄州061000

系統性紅斑狼瘡（Systemic lupus erythemato?sus，SLE）是典型的自身免疫性疾病，隨著疾病的進展可累及多個臟器，以腎臟損傷最為常見［1］。在預測SLE 患者疾病進展及預后方面預測難度大。既往對SLE 疾病進展的研究主要集中在評估患者臨床表現及實驗室檢查參數方面，但預測效果不盡人意［2］。隨著對SLE 深入研究證實腎功能不全是SLE 預后最可靠的預測因子［3］，然而，目前尚無準確預測SLE 預后的生物標志物。Toll 樣受體9（Toll?like receptors?9，TLR9）是參與非特異性免疫的重要蛋白質分子，也是連接非特異性免疫和特異性免疫的橋梁，廣泛表達于SLE 患者單核細胞、T 細胞和B細胞中的跨膜受體中。也有研究表明，TLR9 mRNA的表達與SLE 疾病活動性相關［4?5］。但少有研究將TLR9 mRNA表達水平用于預測SLE 疾病進展風險的預測，基于此，本研究通過測定TLR9 mRNA的表達水平，并探討其與SLE 患者疾病進展的相關性。

1 資料和方法

1.1 臨床資料

納入2016年6月至2018年3月在本院診斷及治療的SLE 患者129 例。其中男性3 例，女性126例；平均年齡（42.87±9.78）歲；平均病程（6.74±2.12）月。納入標準：①符合SLE 診斷標準，并確診為SLE 的患者［6］；②入組前未使用類固醇或免疫抑制劑等；③臨床資料完整；④簽署知情同意書。排除標準：①合并其他器官或組織腫瘤；②合并嚴重心血管系統疾病；③活動性感染；④依從性差，不配合隨訪者。本實驗經醫院倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 治療方法

所有入組患者均參照2010年版中華醫學會風濕病學分會制定的《系統性紅斑狼瘡診斷及治療指南》［7］的治療方案進行治療，包括甲基強的松龍［Pfizer Italia S.r.l。（意大利），批準文號H20150245］0.5 mg/kg/d，羥氯喹（上海上藥中西制藥有限公司，國藥準字H19990263）400 mg/d，環磷酰胺（通化茂祥制藥有限公司，國藥準字H22022673）100 mg/2d，霉酚酸鹽（上海羅氏制藥有限公司，國藥準字H20031277）25 mg/kg/d，環孢素（杭州中美華東制藥有限公司，國藥準字H20031277）3 mg/kg/d，甲氨蝶呤（通化茂祥制藥有限公司，國藥準字H22022674）10～15 mg/w，硫唑嘌呤［Excella GmbH（德國），批準文號H20170288］50 mg，2 次/d。

1.2.2 TLR9 mRNA 表達水平測定

收集所有患者在免疫抑制治療前和2年后的外周靜脈血樣本2 mL；在4℃，1 000 r/min 的條件下離心10 min，使用總RNA 提取試劑盒（購自Thermo Fisher Scientifc 公司）進行提取，提取后置于-80℃冰箱保存。使用TRIzol 從全血中分離總RNA；使用BioTek SynergyTMH1 雜交解讀器測定RNA 純度；使用Takara Biotechnology 公司生產的PrimeScript RT 試劑盒將RNA樣本逆轉錄為cDNA；使用Thermo Fisher Scientific 生產的SYBR Green PCR Master Mix 試劑盒和ABI 7500 Real?Time PCR 系統檢測TLR9 mRNA相對于GAPDH 的水平；定量測量使用2?ΔΔCt方式。引物序列為：TLR9正向，5′?CTG CCT TCC TAC CCT GTG AG?3′和反向，5′?GGA TGC GGT TGG AGG ACA A?3′；GAPDH正向，5′?CGG ATT TGG TCG TAT TGG G?3′和反向，5′?TCT CGC TCC TGG AAG ATG G?3′。

1.3 觀察指標

收集兩組患者一般資料包括年齡、性別、BMI等；實驗室檢查資料包括持續性蛋白尿、C 反應蛋白水平、IgG、C3、C4、IgA、IgM、SLEDAI、白細胞計數、腎小球濾過率、血清肌酐等。

1.4 隨訪

兩組患者均門診隨訪2年，隨訪項目包括SLE病情及疾病進展情況，對病情加重的患者調整治療方案，隨訪截止時間2020年3月17日。疾病進展定義為在隨訪期間患者出現SLE 相關性死亡或活動性疾病。

1.5 統計學處理

采用SPSS 20.0 統計軟件對數據進行分析，計量資料以（）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗；計數資料采用n（%）表示，采用χ2檢驗；采用Logistic回歸方程分析SLE病情及疾病進展的獨立危險因素，繪制工作特征曲線（ROC）評估TLR9mRNA 的表達水平與SLE 病情及疾病進展的相關性，K?M 生存曲線分析不同TRL9mRNA 表達水平的SLE 患者疾病進展風險；以P<0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 SLE 患者疾病進展情況及分組

隨訪2年，截止末次隨訪時間2020年3月17日，129 例患者共5 例因不同原因失訪，共計124例患者完成隨訪，共60 例患者發生疾病進展，將其作為進展組，余64 例未發生疾病進展的患者作為非進展組。

2.2 兩組患者臨床資料比較

進展組持續性蛋白尿、c 反應蛋白水平、TLR9mRNA 高于非進展組，差異有統計學意義（P<0.05），其余組間比較，差異無統計學意義（P>0.05）。見表1。

表1 兩組患者臨床資料比較［n（%），（±s）］Table 1 Comparison of clinical data between 2 groups［n（%），（±s）］

表1 兩組患者臨床資料比較［n（%），（±s）］Table 1 Comparison of clinical data between 2 groups［n（%），（±s）］

臨床資料年齡（歲）性別（女/男）BMI（kg/m2）吸煙持續性蛋白尿（g/d）SBP（mmHg）DBP（mmHg）c 反應蛋白水平（mg/L）IgG IgA IgM C3 C4白細胞計數血清胱抑肽C（mg/L）尿酸（μmol/L）BUN（mmol/L）SCr（μmol/L）TLR9 mRNA表達進展組（n=60）41.45±10.47 59/1 24.42±3.51 43 23.75±1.42 146.82±10.81 95.33±10.75 6.14±1.08 21.76±4.61 3.51±0.74 1.45±0.34 0.64±0.17 0.10±0.03 613.18±100.22 2.52±0.80 363.89±78.60 8.56±2.61 73.47±22.73 40451.75±8587.21非進展組（n=64）43.19±12.84 62/2 23.25±3.18 38 12.63±1.87 143.77±10.55 93.47±11.68 4.80±1.51 22.78±4.72 3.84±0.81 1.40±0.30 0.70±0.21 0.11±0.03 649.27±80.57 2.75±0.71 389.65±75.87 8.27±2.34 72.85±23.82 26214.77±6132.57 χ2/t 值0.618 0.279 1.450 2.066 27.760 1.186 0.689 4.249 0.908 1.768 0.647 1.306 1.384 1.646 1.262 1.385 0.485 0.111 7.905 P 值0.539 0.597 0.152 0.151<0.001 0.240 0.494<0.001 0.367 1.768 0.260 0.098 0.085 1.646 0.106 0.085 0.314 0.111<0.001

2.3 SLE 患者疾病進展風險的預測因素分析

Logistic 多因素顯示持續性蛋白尿、c 反應蛋白水平、TLR9mRNA 表達水平是SLE 患者疾病進展風險的獨立危險因素。見表2。

表2 多因素Logistic 分析結果Table 2 Multi?factor Logistic analysis results

2.4 兩組患者疾病進展發生風險比較

以TLR9mRNA 表達水平中位數為界值，分為TLR9 低表達組（n=62）和TLR9 高表達組（n=62）；K?M 生存分析曲線顯示，TLR9 高表達組SLE 患者2年疾病進展風險高于TLR9 低表達組（log?rankχ2=5.971，P=0.015）。見圖1。

圖1 兩組患者疾病進展發生風險比較Figure 1 Comparison of the risk of disease progression between 2 groups

2.5 TLR9 mRNA 表達水平預測SLE 疾病進展風險的效能

鈣蛋白酶?1 預測TLR9mRNA 表達水平預測SLE 疾病進展風險的AUC 為0.958，高于持續性蛋白尿、c 反應蛋白水平。見表3、圖2。

表3 TLR9 mRNA 表達水平預測SLE 疾病進展風險的效能Table 3 The efficacy of TLR9 mRNA expression level in predicting the risk of SLE disease progression

圖2 TLR9 mRNA 表達水平預測SLE 疾病進展風險的ROC 曲線Figure 2 The ROC curve of TLR9 mRNA expression level predicting the risk of SLE disease progression

3 討論

SLE 為自身免疫性疾病，發病機制復雜，其確切機制至今尚未完全清楚［8］。TLR9 是存在于一線防御細胞上的一種識別病原體相關分子模式（pathogen?associated molecular pattern，PAMP）的受體［9］。有學者［10］應用系列TLR 配體刺激RAW264.7 發現TLR 能夠上調免疫反應；TLR 通過可能通過某種細胞反應誘發機體自身免疫反應或促進自身免疫性疾病進展。

TLR9 由TLR9mRNA 轉錄而來，是一種跨膜受體，由含亮氨酸重復序列的胞外區、含半胱氨酸的跨膜區以及具有核心元件的胞內區組成，胞內區結構與白介素?1 型保內結構域高度同源，具高度保守空間結構，直接參與下游信號傳導［11］。既往研究表明［12?13］TLR9 在SLE 單核細胞、T 細胞和B 細胞中高表達，活動性SLE 患者中TLR9 表達較非活動期對照升高。本研究結果提示TLR9參與了活動性SLE 的疾病進展機制。

既往研究指出［14］血管炎、血液異常及腎小球腎炎是SLE 患者臨床無緩解的獨立危險因素。研究表明［15］腎臟、神經功能損傷緩解是SLE 患者預后良好的獨立預測因素。本研究結果與以往結果部分相似，證實腎臟功能受累及c 反應蛋白水平升高是SLE 疾病進展的獨立危險因素。另發現TLR9mRNA 也是SLE 患者疾病進展的危險因素。ROC 曲線結果說明高水平TLR9 mRNA表達可預測SLE 患者疾病進展。TLR9 在SLE 發病機制中的作用尚未明確。先前動物研究表明［16］TLR9的激活可導致MRL?Fas 狼瘡易發小鼠腎炎的進展，可能為TLR9 的激活誘發了自身免疫反應，影響了患者自身抗體的產生。在另一項動物研究中敲除SLE 小鼠TLR9 后小鼠抗DNA 成分自身抗體明顯減少，主要表現為抗核小體抗體明顯減少［17］，而在SLE 中發現核小體、自身抗體等在SLE 疾病的發展過程中起著重要作用。TLR9 及其信號通路與SLE自身抗體的轉型有關，在SLE 小鼠模型中發現自身抗體IgG2a、2b亞型是致病的主要亞型［18］，對自身腎小球基底膜、DNA 等是反應性自身抗體。TLR9 及其信號通路與自身抗體向IgG2a、2b亞型密切相關。TLR9 缺失的SLE 小鼠IgG2a、2b亞型水平明顯減少，病理損傷明顯減輕，生存期也明顯延長［19］。提示TLR9mRNA 的高表達SLE 患者存在嚴重的自身免疫反應，自身免疫反應越重，恢復越困難，致患者預后差。

綜上所述，持續性蛋白尿、C 反應蛋白水平、TLR9mRNA 高表達是SLE 患者疾病進展的危險因數，TLR9 參與了SLE 的發病機制，TLR9mRNA高表達可能預測SLE 在2年內的進展情況，因此，TLR9mRNA 高表達水平可作為預測SLE 患者疾病進展風險的重要生物標志物。同時本研究還存在不足之處，本研究測量的TLR9mRNA 表達水平是機體在某一時間點的結果，其不代表整個疾病進展時間段。另外由于樣本量較少且來源較單一，會影響研究結果，因此后期我們將進行大樣本、多中心、連續時間的研究。