miR?32?5p靶向FOXN3調控EMT通路影響子宮內膜癌細胞遷移和侵襲

董艷 杜安飛 辛本勤 曹佳偉

作者單位：1.日照市婦幼保健院檢驗科，山東，日照276800

2.日照市莒縣中醫醫院檢驗科，山東，日照276800

3.日照市中心血站，山東，日照276800

4.青島市胸科醫院檢驗科，山東，青島266000

子宮內膜癌（endometrial cancer，EC）是最常見的婦科惡性腫瘤之一，發病率呈上升趨勢［1］。標準治療包括原發性子宮切除術和雙側輸卵管卵巢切除術［1］，為提高復發或轉移患者的生存質量，個性化的分子靶向治療也在進行研究和試驗。研究顯示胰腺癌中miR?32?5p 表達上調，并通過下調第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因（phosphatase and tensin homologue deleted onchro?mosome ten，PTEN）表達促進胰腺癌轉移［2］。宮頸癌中miR?32?5p 低表達，miR?32?5p 通過靶向同源盒B8（homeobox B8，HOXB8）抑制宮頸癌細胞惡性行為［3］。有報道稱EC 中miR?32?5p 高表達［4］，但其在EC 中的作用并未闡明。叉頭蛋白N3（Fork head Box N3，FOXN3）是一種轉錄抑制因子，參與細胞周期調控和腫瘤發生等過程［5］。研究顯示FOXN3 在肝癌、肺癌、乳腺癌等惡性腫瘤中顯著下調，上調FOXN3 可抑制癌細胞的上皮?間充質轉化（epithelial mesenchymal transition，EMT）進程，抑制腫瘤轉移，在癌癥進展中充當抑癌基因角色［6］。本研究通過Starbase 預測發現，miR?32?5p與FOXN3可能存在靶向關系。

1 材料與方法

1.1 材料

人正常子宮內膜上皮細胞hEEC 購自北納生物，EC 細胞JEC 由本院子宮內膜癌患者自愿捐贈，EC 細胞系Ishikawa 和HEC?1A 購自美國ATCC；McCoy's 5a 培養基、杜爾伯格伊戈爾培養基（dulbecco's modified eagle medium，DMEM）和胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）購自美國Gibco 公司；引物、miR?32?5p 模擬物（miR?32?5p）、miR?32?5p抑制劑（anti?miR?32?5p）、FOXN3 過表達載體（pcDNA?FOXN3）、FOXN3 抑制劑（si?FOXN3）和對照（miR?con、anti?miR?con、si?con 和pcDNA?con）、FOXN3 的野生型（wild type，WT）和突變型（mutant type，MUT）雙熒光素酶報告載體購自上海吉瑪制藥有限公司；FOXN3 抗體、E?鈣粘蛋白（E?Cadherin）抗體、N?鈣粘蛋白（N?Cadherin）抗體和波形蛋白（Vimentin）抗體購自英國Abcam 公司；β?actin 抗體購自上海碧云天生物技術有限公司；雙熒光素酶報告系統購自美國Promega 公司；Lipofectamine 2000 轉染試劑、總RNA 提取試劑盒、real?time PCR 試劑盒、反轉錄試劑盒購自美國Invitrogen 公司；光學顯微鏡、全自動酶標儀、發光儀和Real?time PCR 儀購自美國Bio?Rad 公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養、轉染

在DMEM 高糖培養液中分別培養hEEC、Ishi?kawa 和JEC 細胞，在McCoy's 5a 培養液中培養HEC?1A 細胞，培養液中均添加10%FBS、100 U/mL青霉素和100 μg/mL 鏈霉素，培養條件：在飽和濕度、37℃5%CO2培養箱中培養細胞，消化傳代。以2×l06個細胞/mL 接種Ishikawa 細胞于6 孔板培養，當細胞基本融合為一層時根據Lipofectamine 2000轉染試劑說明書進行轉染。未轉染細胞記為正常對照（NC）組（①組）。根據轉染物不同分為anti?miR?32?5p 組（②組）、anti?miR?con 組（③組）、pcDNA?con組（④組）、pcDNA?FOXN3 組（⑤組）、miR?con 組（⑥組）、miR?32?5p 組（⑦組）、anti?miR?32?5p+si?con組（⑧組）、anti?miR?32?5p+si?FOXN3組（⑨組）、miR?con+WT?FOXN3 組（⑩組）、miR?32?5p+WT?FOXN3組（○1組）、miR?con+MUT?FOXN3 組（○12組）、miR?32?5p+MUT?FOXN3 組（○13組）。轉染48 h，收集細胞，qRT?PCR 檢測Ishikawa 細胞中miR?32?5p 或FOXN3 表達水平來驗證轉染效果，進行后續實驗。

1.2.2 qRT?PCR 檢測RNA 的表達

用Total RNA 提取試劑盒從EC 細胞中提取細胞總RNA，然后反轉錄合成cDNA，反應程序為30℃10 min，42℃30 min，99℃5 min；4℃5 min。cDNA 并檢測，然后以cDNA 為模板，按照real?time PCR 試劑盒的說明書進行反應，合成miR?32?5p 和FOXN3 mRNA，反應程序為：95℃2 min；95℃30 s、60℃40 s、72℃45 s，35 個循環；72℃5 min。運用2?ΔΔCt方法進行數據分析。

1.2.3 Transwell 檢測細胞遷移和侵襲能力

用無血清DMEM 培養液稀釋細胞至濃度2×105個細胞/mL，Transwell 上室加100 μL 細胞懸液，下層加含20% FBS 的培養液。培養箱孵育24 h，用無菌棉簽拭去上層小室未遷移細胞，5%甲醛固定遷移細胞，0.1%結晶紫染色，顯微鏡隨機選擇5個視野拍照、計數，以平均值表示Ishikawa 細胞侵襲數量。采用Matrigel 基質膠包被的Transwell 裝置，其他步驟同遷移實驗。

1.2.4 Western blot 實驗

RIPA 裂解液室溫裂解各組Ishikawa 細胞，BCA試劑盒檢測蛋白濃度。以β?actin 為內參照，分析蛋白水平。

1.2.5 雙熒光素酶報告系統實驗

將構建的WT?FOXN3 和MUT?FOXN3 分別與miR?con 或miR?32?5p 共轉染Ishikawa 細胞，轉染48 h，裂解細胞，離心收集上清，直接檢測熒光素酶活性。以海腎熒光素酶活性為內參照，計算相對螢火蟲熒光素酶活性。

1.3 統計學處理

用SPSS 19.0 軟件進行數據統計分析；計量資料以（）表示，兩組間采用獨立樣本t檢驗，多組間采用單因素方差分析；以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 EC 系中miR?32?5p 和FOXN3 的表達情況

與hEEC 細胞相比，Ishikawa、HEC?1A 和JEC組細胞中miR?32?5p 表達量均顯著升高，差異有統計學意義（P<0.05），FOXN3mRNA 和蛋白表達量均顯著下降，差異有統計學意義（P<0.05）。見表1。

表1 EC 細胞系中miR?32?5p 和FOXN3 的表達情況（±s）Table 1 Expression levels of miR?32?5p and FOXN3 in EC cell lines（±s）

表1 EC 細胞系中miR?32?5p 和FOXN3 的表達情況（±s）Table 1 Expression levels of miR?32?5p and FOXN3 in EC cell lines（±s）

組別hEEC Ishikawa HEC?1A JEC F 值P 值n9 9 9 miR?32?5p 1.00±0.10 2.35±0.24 1.86±0.19 1.75±0.18 82.369 0.000 FOXN3 mRNA 1.00±0.10 0.24±0.03 0.32±0.04 0.38±0.05 290.800 0.000

2.2 miR?32?5p 低表達對Ishikawa 細胞遷移和侵襲的影響

與anti?miR?con 組相比，anti?miR?32?5p 組的Ishikawa 細胞中miR?32?5p 表達量顯著降低，差異有統計學意義（P<0.05）；E?Cadherin 表達升高，N?Cadherin 和Vimentin 表達量均降低（P<0.05），遷移和侵襲細胞數均顯著降低（P<0.05）。見表2。

表2 miR?32?5p 低表達對Ishikawa 細胞遷移和侵襲的影響（±s，n=9）Table 2 Effects of miR?32?5p low expression on migration and invasion of Ishikawa cells（±s，n=9）

表2 miR?32?5p 低表達對Ishikawa 細胞遷移和侵襲的影響（±s，n=9）Table 2 Effects of miR?32?5p low expression on migration and invasion of Ishikawa cells（±s，n=9）

組別①組②組③組F 值P 值miR?32?5p 1.00±0.11 1.00±0.10 0.38±0.04 145.975 0.000 E?Cadherin 0.32±0.03 0.30±0.04 0.75±0.08 196.079 0.000 N?Cadherin 1.10±0.12 1.15±0.13 0.45±0.05 121.820 0.000 Vimentin 0.90±0.10 0.92±0.09 0.38±0.04 128.467 0.000細胞遷移數量223.05±22.50 225.46±22.34 102.78±10.38 119.350 0.000細胞侵襲數量150.43±15.27 146.45±13.65 81.16±8.11 84.173 0.000

2.3 FOXN3 高表達對Ishikawa 細胞遷移和侵襲的影響

與pcDNA?con 組相比，pcDNA?FOXN3 組的Ishikawa 細胞中FOXN3 表達量顯著升高（P<0.05），E?Cadherin 蛋白表達水平顯著升高（P<0.05），N?Cadherin 和Vimentin 蛋白表達水平顯著降低（P<0.05），細胞遷移和侵襲數量顯著降低（P<0.05）。見表3。

表3 FOXN3 高表達對Ishikawa 細胞遷移和侵襲的影響（±s，n=9）Table 3 Effects of FOXN3 overexpression on migration and invasion of Ishikawa cells（±s，n=9）

表3 FOXN3 高表達對Ishikawa 細胞遷移和侵襲的影響（±s，n=9）Table 3 Effects of FOXN3 overexpression on migration and invasion of Ishikawa cells（±s，n=9）

組別①組④組⑤組F 值P 值FOXN3 0.30±0.03 0.35±0.04 0.85±0.09 235.613 0.000 E?Cadherin 0.35±0.04 0.36±0.05 0.72±0.07 133.300 0.000 N?Cadherin 1.08±0.11 1.05±0.12 0.45±0.06 113.292 0.000 Vimentin 0.88±0.08 0.90±0.09 0.41±0.04 128.963 0.000細胞遷移數量225.01±22.51 224.18±22.52 98.25±9.91 129.195 0.000細胞侵襲數量153.28±15.39 148.07±15.03 72.18±7.50 107.199 0.000

2.4 miR?32?5p 靶向FOXN3

FOXN3 的3'?UTR 與miR?32?5p 的結合位點，見圖1。與miR?con+WT?FOXN3 組相比，miR?32?5p+WT?FOXN3 組Ishikawa 細胞的熒光素酶相對活性顯著降低（P<0.05）；而與miR?con+MUT?FOXN3 組比較，miR?32?5p+MUT?FOXN3 的熒光素酶相對活性無明顯變化。與anti?miR?con組比較，anti?miR?32?5p 組Ishikawa 細胞中FOXN3表達量顯著升高（P<0.05）。見表4、表5。

圖1 miR?32?5p 靶向調控FOXN3 表達Figure 1 miR?32?5p targets and regulates the expression of FOXN3

表4 雙熒光素酶活性檢測（±s，n=9）Table 4 Double luciferase activity assay（±s，n=9）

表4 雙熒光素酶活性檢測（±s，n=9）Table 4 Double luciferase activity assay（±s，n=9）

組別分組⑩○1○12○13 t 值P 值熒光素酶相對活性1.00±0.15 0.33±0.03 13.140 0.000 t 值P 值熒光素酶相對活性1.01±0.12 0.98±0.11 0.553 0.588

表5 Western Blot 檢測FOXN3 的表達（±s，n=9）Table 5 The expression level of FOXN3 was detected by Western blot（±s，n=9）

表5 Western Blot 檢測FOXN3 的表達（±s，n=9）Table 5 The expression level of FOXN3 was detected by Western blot（±s，n=9）

組別⑥組⑦組②組③組F 值P 值FOXN3 0.32±0.03 0.10±0.01 0.36±0.04 0.75±0.08 292.367 0.000

2.5 敲減FOXN3 逆轉miR?32?5p 低表達對Ishika?wa 遷移和侵襲的影響

與miR?32?5p+si?con 組相比，miR?32?5p+si?FOXN3 組的FOXN3 和E?cadherin 表達量顯著降低（P<0.05），N?cadherin 和Vimentin 表達顯著上升，遷移和侵襲細胞數均顯著上升（P<0.05）。見表6。

表6 敲減FOXN3 逆轉miR-32?5p 低表達對Ishikawa 遷移和侵襲的影響（±s，n=9）Table 6 Knockdown of FOXN3 reversed the effect of downr?expression of miR?32?5p on migration and invasion of Ishikawa cells（±s，n=9）

表6 敲減FOXN3 逆轉miR-32?5p 低表達對Ishikawa 遷移和侵襲的影響（±s，n=9）Table 6 Knockdown of FOXN3 reversed the effect of downr?expression of miR?32?5p on migration and invasion of Ishikawa cells（±s，n=9）

組別②組③組⑧組⑨組F 值P 值FOXN3 0.35±0.04 0.76±0.08 0.78±0.09 0.42±0.05 97.339 0.000 E?Cadherin 0.30±0.03 0.70±0.10 0.72±0.08 0.38±0.04 89.079 0.000 N?Cadherin 1.10±0.13 0.40±0.04 0.42±0.05 1.00±0.10 160.568 0.000 Vimentin 0.90±0.10 0.36±0.04 0.40±0.05 0.80±0.09 122.541 0.000細胞遷移數223.67±22.37 113.46±11.35 110.32±11.04 200.49±20.05 107.308 0.000細胞侵襲數151.37±15.16 80.42±8.05 82.14±8.25 131.09±13.11 85.329 0.000

3 討論

EC 多發于老年婦女，其發病率和死亡率呈上升趨勢，發病年齡較前幾年有所下降［7?8］。研究EC的分子抑制靶點，對患者的個性化靶向治療具有重要意義。

miR?32?5p 在多種癌癥中出現差異表達，在癌細胞的凋亡、化學敏感性、轉移和耐藥性中起著重要作用。前列腺癌中順鉑治療后miR?32?5p 表達下調，參與調節前列腺癌化學敏感性［9］。透明細胞腎細胞癌中miR?32?5p 高表達促進癌細胞侵襲和遷移，舒尼替尼也通過調控miR?32?5p 發揮抑癌作用［10］。肝癌多藥耐藥細胞中miR?32?5p 表達升高，誘導多藥耐藥［11］。miR?32?5p 在EC 中表達上調，其具體作用和機制尚不清楚。本研究結果表明，EC細胞系Ishikawa、HEC?1A 和JEC 中miR?32?5p 表達均顯著升高，與上述研究結果［7］一致；采用表達差異較大的Ishikawa 細胞進行功能分析，結果表明低表達miR?32?5p 可抑制Ishikawa 細胞遷移和侵襲。說明miR?32?5p 在EC 的發展中具有重要作用。

Starbase 預測發現FOXN3 的3'?UTR 與miR?32?5p 存在結合位點，提示兩者存在調控關系。FOXN3 編碼叉頭/翼螺旋轉錄因子家族的一個成員，可通過與Ski 相互作用蛋白（Ski interacting protein，SKIP）結合參與細胞基本過程調控，在腫瘤發生和對癌癥治療的反應中起重要作用［12］。結直腸癌中FOXN3 顯著下調，被證實是N?cadherin的直接轉錄抑制因子，對腫瘤的遷移、侵襲和轉移均具有重要作用［13］。FOXN3 在骨肉瘤中下調，上調FOXN3 抑制骨肉瘤遷移和侵襲［14］。FOXN3 在EC中的表達和作用尚不清楚。本研究結果說明FOXN3 在EC 細胞的轉移中具有重要作用。此外，miR?32?5p靶向負調控FOXN3表達，敲減FOXN3部分逆轉了抑制miR?32?5p 表達對Ishikawa 細胞遷移和侵襲的影響，證實了在EC 中兩者存在調控關系。

EMT 是腫瘤細胞轉移的重要前提，在此過程中上皮細胞極性喪失，形成了一種以細胞骨架重塑和遷移活動為特征的間充質樣特性［15］。本研究發現，Ishikawa 細胞中miR?32?5p 低表達和FOXN3過表達均可抑制間質標志物N?cadherin 和Vimentin表達，促進上皮標志物E?cadherin 表達，抑制EMT進程，而敲減FOXN3 部分逆轉了抑制miR?32?5p表達對細胞EMT 的影響，這與Chen 等［16］報道FOXN3 在舌鱗癌中的抗EMT 作用吻合。

綜上所述，本研究證實，miR?32?5p 靶向FOXN3 可能通過抑制EMT 通路抑制EC 細胞的遷移和侵襲。miR?32?5p 可能是EC 的潛在分子靶點。