潮州市新生兒G6PD篩查和基因型鑒定分析

陳新瑤 梁雪雁 黃慧瑩 林偉琦 丁燕佳 韋華貴 王俊利 林敏

作者單位：1.汕頭大學醫學院附屬潮州市人民醫院中心實驗室，廣東，潮州521011

2.右江民族醫學院檢驗學院，廣西，百色533000

3.韓山師范學院食品工程與生命科學院，廣東，潮州521011

葡萄糖?6?磷酸脫氫酶（Glucose?6?phosphate dehydrogenase，G6PD）缺乏癥俗稱蠶豆病，是由于紅細胞膜的G6PD 缺乏引起紅細胞破壞并溶血的一種遺傳性疾病［1］。G6PD基因位于染色體Xq28的片段，全長18.5 Kb，包含13 個外顯子及12 個內含子。絕大多數的G6PD 缺乏癥都是由于G6PD基因突變導致的，目前全球已經發現400 余種突變。G6PD 缺乏癥是世界上最常見的紅細胞遺傳病之一，全球患病率約為5%，呈明顯的地域性和種族性分布［2］，主要分布在東南亞、印度次大陸、中東地區及地中海沿岸和非洲地區。我國患病率在0.2%～44.8%之間，以兩廣、海南為高發區［3?5］。G6PD 缺乏癥是新生兒病理性黃疸的主要發病因素，據文獻報道，患G6PD 缺乏癥的新生兒中約50%發生黃疸，其中12%會發展為核黃疸［6］，從而導致腦部損害，引起智力低下。為了解潮州地區人群G6PD 缺乏癥分子流行病學特征，為本地區G6PD 缺乏癥的防控提供依據，本研究總結了新生兒G6PD 活性篩查數據，并對部分樣本進行基因型鑒定，結果匯總如下。

1 資料與方法

1.1 病例來源

選取2012年1月至2019年12月本院出生的34 813 份新生兒篩查樣本，其中男性新生兒18 880例，女性新生兒15 933 例。本項目已獲得本院倫理委員會批準，所有受試者監護人均簽訂知情同意書。

1.2 G6PD 活性篩查

根據《廣東省新生兒疾病篩查管理辦法》的標準［7］，嚴格按照操作規程，對出生72 h 以上的新生兒用里定血樣標本采集卡采集足后跟血樣制備血斑，自然干燥晾干后分別獨立裝進封口袋，送新生兒篩查實驗室，并置2～8℃冰箱保存，一周內完成G6PD 活性篩查。剩余標本置-70℃低溫保存箱保存，備分子生物學檢測。根據《新生兒疾病篩查技術規范》［8］，采用廣州巿豐華生物工程有限公司的葡萄糖?6?磷酸脫氫酶熒光分析試劑盒，嚴格按照操作說明進行G6PD 活性篩查。結果判定［9］：以G6PD 活性2.6 U/gHb 為界限，小于該值判為G6PD酶缺乏或減少，即為初篩陽性標本。

1.3 DNA 提取

從所有樣本中隨機抽取酶學缺乏的420 份男性樣本進行分子生物學研究。實驗過程如下：用歐歌重型打孔鉗打下直徑3 mm 的紙片各3 個，采用天根生物干血斑提取試劑盒制備DNA，DNA 質量由美國芬蘭1510?05665 全波長酶標儀進行評價，在260～280 nm 的波長測定，并將其調整到10 ng/μL，保存于海爾DW?86L486 醫用低溫（-70℃）保存箱中。

1.4 基因型鑒定

上述DNA 采用廣東凱普生物有限公司生產的葡萄糖?6?磷酸脫氫酶基因檢測試劑盒（PCR?導流雜交法），可檢測中國人群常見的14 種G6PD基因突變類型：c.95A>G、c.392G>T、c.487G>A、c.493A>G、c.592C>T、c.871G>A、c.1004C>T、c.1024C>T、c.1311C>T、c.1360C>T、c.1376G>T、c.1381G>A、c.1387C>T、c.1388G>A。嚴格按照試劑說明進行操作及判讀。

1.5 統計分析

采用SPSS 20.0 軟件進行統計分析。計數資料采用n（%）表示，行χ2檢驗；采用χ2檢驗檢測基因頻率是否符合Hardy?Weinberg 平衡定律，P>0.05為群體基因符合遺傳平衡法則，樣本數據來自同一孟德爾群體。以P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 潮州地區G6PD缺乏癥酶學篩查與性別的關系

34 813份新生兒篩查樣本中共篩查出G6PD缺乏樣本1 167份，總陽性率為3.35%，男性檢出率（4.75%）明顯高于女性（1.69%），差異有統計學意義（P<0.05）。

2.2 潮州地區G6PD 缺乏癥突變譜

420 例男性酶缺乏標本中，檢出9 種G6PD突變等位基因的樣本占86.90%（365/420），其中最常見的5 種為c.1376 G>T、c.1388 G>A、c.95 A>G、c.1024C>T 和c.1311C>T。所有的c.871 G>A 均與c.1311C>T 連鎖。見表1、圖1。

表1 潮州地區420 例男性新生兒G6PD 缺乏癥基因突變型別Table 1 Genotypes of G6PD deficiency in 420 male newborns in Chaozhou area

圖1 G6PD 斑點雜交圖譜Figure 1 Dot blot hybridization result of G6PD

2.3 G6PD 基因突變譜與酶活性的關系

分析上述男性新生兒G6PD活性與基因型的關系（c.487 G>A 樣本太少，剔除），發現未檢出突變的男性新生兒酶活性明顯高于檢出突變的樣本，差異有統計學意義（P<0.05）。攜帶c.871G>A 連鎖c.1311C>T 突變的樣本酶活性明顯低于單一突變樣本，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖2。

圖2 基因突變譜與酶活性的關系Figure 2 Relationship between gene mutation profile and enzyme activity

3 討論

我國是G6PD 缺乏癥的高發區，研究表明，我國G6PD 缺乏癥的發生率與緯度呈現反相關：隨著緯度的升高/北移，G6PD 缺乏癥的發生率下降，呈現“南高北低”的分布特點［3，10］。文獻報道，我國北緯30°以北（長江以北）為低瘧疾區，北緯25°至32°為中瘧疾區，北緯25°以南為高瘧疾區［11］。本研究潮州地區地處高瘧區與中瘧區的交界處，研究結果表明G6PD 缺乏癥的發生率明顯低于更低緯度（高瘧區）的崇左、惠州［3，12］，但高于位于中瘧區的地區如福州、溫州［13?14］，與此前報道的關于我國G6PD 缺乏癥的分布地域特點“瘧疾正向選擇假說”相一致［11］。

G6PD 缺乏癥為X 連鎖不完全顯性遺傳病，在男性群體中只存在正常或顯著缺乏的兩種半合子人群。因而，男性只要攜帶G6PD突變基因就會發病且表現為G6PD 重度缺乏。女性有2 條X染色體，X 染色體隨機失活在女性群體中只有純合子以及部分攜帶突變的雜合子表現出不同程度的酶缺乏。本研究中男、女G6PD 缺乏癥發生率分別為4.75%和1.69%，符合X 染色體連鎖不完全顯性遺傳的規律。迄今為止，全球共報道G6PD基因突變類型約220 多種［15］，其中在我國人群中發現33 種突變，最常見突變類型為c.1388G>A、c.1376G>T 和c.95A>G［11］。本研究結果與相關文獻報道的中國人最常見的3 種G6PD基因類型相符［16］。有報道曾指出國內人群中的c.1311C>T 基因型常復合其他突變類型，發生率在5.1%～24%［17］。本研究中c.1311C>T 基因型的發生頻率為4.76%，其中3.33%以復合形式出現，與之前的研究結果相一致［17?18］。值得關注的是，復合突變的標本G6PD 活性均明顯低于單一突變的標本，這與有關文獻指出復合突變可降低G6PD 活性的報道一致［18］。

綜上所述，潮州地區新生兒G6PD 缺乏癥發生率與本地區前期文獻［19］研究數據對比有明顯上升趨勢，本研究小組推測幾個可能原因：各地區人群交流日益頻繁而使本地區人口結構不斷變化；本次研究樣本數量及時間跨度大，更能客觀反映潮州地區新生兒G6PD 缺乏癥發生率的情況。

G6PD 缺乏癥目前尚無根治辦法，僅能依據病情進行對癥處理。因此，對新生兒進行G6PD 活性篩查并且加快普及基因突變檢測，既能精準發現突變位點，又可避免發生漏診的情況。隨著分子生物學診斷技術的發展以及成本的降低，基因檢測有望成為潮州地區G6PD 普查的一種新方法，從而積極而且有效地預防和控制誘因，對患兒早期治療具有積極意義。