種莖對多花黃精產量和藥用品質的影響

崔闊澍，Aftab Ahmed，Aaqil Khan，George Bawa，方清茂，李 軍，朱文濤，金 福，時健祎，彭 騰，吳茂力，肖 特,，楊文鈺

（1四川省農業技術推廣總站，成都 610041；2四川農業大學農學院/農業部西南作物生理生態與耕作重點實驗室，成都 611130；3四川省中醫藥科學院，成都 610041；4成都中醫藥大學，成都611137；5四川省原子能研究院，成都 610066）

0 引言

多花黃精(Polygonatum cyrtonema)是中國瀕危野生藥用植物[1-3]，四川、貴州、湖南、湖北、河南、安徽、廣西等地為主要分布區域，集藥用、食用、飼用、觀賞價值于一身，為中國三十大稀缺藥材之一[4-5]，常用根莖繁殖，由于其根莖呈連珠狀或結節成塊，習稱“種莖”[6-7]。優良的種莖是保障中藥材生產的先決條件，因多花黃精人工馴化和栽培研究還處于起步階段，選種用種的科學理論還不完善，導致種莖質量參差不齊，對后續藥材的生產及品質產生很大影響，造成缺苗、弱苗、產量低、藥用品質差等問題[8-11]。目前，已有學者進行了一些研究。李世[6]于1986年5—9月中旬研究發現種莖長度對出苗、生長及產量等均有顯著影響。長度4 cm的出苗率顯著降低，長度6 cm的略低，長度8～14 cm的差別不大。楊子龍、宗燕等[12-13]發現，黃精根莖繁殖，每段須具2～3節，但大田當年移栽植株越冬芽萌動遲緩，發芽率低，有的植株到第2年才發芽，并且黃精發芽時間不一致，發芽勢較低。畢勝等[14]認為黃精需種莖繁殖，每段2～3節，長度8～12 cm。宮俊華、鄧穎連等[15-16]研究發現不同節數黃精根莖出苗整齊度有差異，出現大量春發株地上部死亡情況。戴琴等[17]認為栽培黃精需選擇健壯、顏色黃潤、無病蟲害、無破皮、具有頂芽的根莖作種。將先端幼嫩部分截成數段，每段2節，有1～3個芽眼。朱伍鳳、Arimura、Rinne、Swartz[18-21]在收獲季節選用1～2年生健壯、無病蟲害植株，挖取根狀莖，選先端幼嫩部分截成數段，每段2～3節，待切口稍晾干收漿后立即栽種，此法做得較好。但均只研究了多花黃精種莖節數，并未考慮多花黃精種莖規格和多年生年齡特性。本研究擬建立一種基于K-means聚類法，將多花黃精種莖規格和年齡進行等級劃分，觀察多花黃精植株和塊莖的生長規律，摸清種莖規格和年齡對藥材產量和藥用品質的影響，以期為科學選種用種提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

種莖無病蟲害、無機械損傷，由四川省中醫藥科學院提供，并由方清茂鑒定為多花黃精(Polygonatum cyrtonema)。

分析天平、電子天平(CTH-553)、紫外可見分光光度計(UV-3010)、游標卡尺和直尺。

硫酸、蒽酮和乙醇為分析純，葡萄糖對照品（純度≥99%，批號50-99-7）購自南京森貝伽生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 種莖K-means聚類法 K-means利用距離作為相似性指標，先給定一個已知數據點集合X(X1,X2,X3,...,Xn)，該集包含n個d維數據點，也給定需要的聚類數目k，k由用戶指定，n個d維數據點劃分到K(K≤n)集合中，k均值算法根據某個距離函數反復把數據分入k個聚類中，從而得出組內平方和最小，如式(1)[22]。

隨機抽取300個多花黃精種莖準確測定單個種莖芽頭數、莖長、莖徑和莖質量，作為種莖規格分級指標，采用K-means聚類法進行聚類分析，將種莖分為3個規格、3個年齡（見表1～2）。

表2 多花黃精種莖年齡分類標準及各年齡段種莖占比

1.2.2 田間試驗設計 試驗地點為四川省資陽市雁江區祥符鎮祥符村(104°29′1.29″N，30°7′56.4″E)，試驗點土壤系紅色沙壤土，2017年1月18日播種，2018年12月10日收獲。

試驗采用雙因素隨機區組設計，主因素為種莖規格(S)，分別為一級(S1)、二級(S2)、三級(S3)；副因素為種莖年齡(A)，分別為1年生(A1)、2年生(A2)、3年生(A3)，隨機區組排列，9 個(S1A1、S1A2、S1A3、S2A1、S2A2、S2A3、S3A1、S3A2、S3A3)處理，每個處理為1個小區，小區面積81 m2(9 m×9 m)，每小區重復3次，共計27個。開溝后芽口朝上栽種，溝深度8 cm，行距30 cm，株距30 cm。每小區下種前施有機肥800 kg，后期大田管理只澆水和除草。

記錄出苗時間，出苗后10天統計出苗率。以1 m2小區為單位測產，小區內采用“S”型5點取樣法，測定單株和單位面積產量。地下和地上部（莖稈和塊莖結合處為分隔點，以上為地上部，以下為地下部）在120℃殺青30 min后于70℃條件下烘干至恒重后，電子天平稱干重。

1.2.3 藥材品質檢測 采用《中華人民共和國藥典（2015年版）》中紫外分光光度法測多花黃精藥材的多糖含量。

（1）配制對照樣品溶液。取無水葡萄糖對照品33 mg（經105℃干燥至恒重），倒入100 mL量瓶中，加水定容至刻度，上下搖勻即得（無水葡萄糖濃度為0.33 mg/mL）[2]。

（2）制定標準曲線。稱取6份對照品溶液，分別為0.l、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL，移至10 mL具塞刻度試管中，加水至2.0 mL刻度，搖勻，立即放入0℃冰水浴中，并緩緩滴入0.2%蒽酮-硫酸溶液至10 mL刻度線，混勻，放冷后置水浴中保溫10 min，立即取出，置0℃冰水浴中，冷卻10 min。設無對照品溶液為空白。參考紫外-可見分光光度法，582 nm波長處測吸光度值。并以濃度為橫坐標、吸光度為縱坐標制作標準曲線[2]。

（3）測定方法。稱取多花黃精藥材細粉約0.25 g（60℃干燥至恒重），置于圓底燒瓶中，加80%乙醇150 mL，然后置水浴中加熱回流，1 h后趁熱濾過，用80%熱乙醇洗滌殘渣3次，每次10 mL，將殘渣及濾紙置燒瓶中，加水150 mL，置沸水浴中加熱回流，1 h后趁熱濾過，殘渣和燒瓶用熱水洗滌4次，每次10 mL，然后合并濾液與洗液，冷卻后轉移至250 mL容量瓶中，加水至刻度，搖勻。量取1 mL，置10 mL具塞干燥試管中，參照標準曲線制備項下方法測定吸光度值，再從標準曲線上讀出供試品溶液中含無水葡萄糖的質量(mg)，后計算即得[2]。

1.2.4 數據分析 采用SPSS 20.0和Excel 2010軟件對試驗數據進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 種莖規格與年齡對多花黃精出苗率的影響

從表3可以得出，多花黃精的出苗率最高達89.68%，最低為56.14%。除1年生種莖中一級和二級不存在極顯著差異，其余種莖在不同規格、年齡下的出苗均存在極顯著差異，表現為一級＞二級＞三級，1年生＞2年生＞3年生。由表4的相關性分析結果可知，出苗率與種莖規格、年齡間相關，相關系數分別為0.875、-0.356，說明在一定范圍內，隨著種莖規格等級的升高出苗率增高，而隨著種莖年齡的增大出苗率降低；種莖規格與年齡間交叉互作現象存在，但互作現象不明顯；各因素對出苗率貢獻（偏η2）由大到小表現為種莖規格＞種莖年齡＞種莖規格×年齡。

2.2 種莖規格與年齡對多花黃精產量的影響

多花黃精單株產量和單位面積產量變化較大，其中單株產量最大為50.16 g，最小為29.75 g；單位面積產量最大為489.80 g，最小為310.74 g（表3）。在不同規格、年齡下的單株產量和單位面積均存在極顯著差異，具有統計學價值，表現為一級＞二級＞三級，1年生＞2年生＞3年生。由表4的分析結果發現，種莖規格與單株產量為極顯著相關，種莖年齡與單株產量達到顯著相關，相關系數分別為0.910、-0.400。當種莖規格升高時，單株產量增加；當種莖年齡變大時，單株產量降低。種莖規格與單位面積產量達到極顯著相關，種莖年齡與單位面積產量達到顯著相關，相關系數分別為0.934、-0.410。當種莖規格升高時，單位面積產量升高；當種莖年齡變大時，單位面積產量降低。兩者間的交互作用同樣存在，但因互作不顯著，不具有統計學價值。偏η2顯示各因素對多花黃精單株產量和單位面積產量貢獻由大到小表現為種莖規格＞種莖年齡＞種莖規格×年齡。

表3 種莖規格與年齡多花黃精產量和塊莖多糖含量

表4 多花黃精種莖規格與年齡互作效應分析

2.3 種莖規格與年齡對多花黃精藥用品質的影響

從表1可知，多花黃精藥材多糖含量在各處理中均高于《藥典》多糖含量不低于7%的標準。多糖含量在SlA2下達到最高(10.85%)，S2A1下達到最低(7.98%)。2年生藥材多糖含量在不同規格下表現為最高，2年生＞3年生＞1年生。由相關性分析結果（表4）得出，多糖含量與種莖規格存在極顯著相關，與種莖年齡存在顯著相關，相關系數分別為0.605、0.397。說明在一定范圍，當種莖規格、年齡逐漸升高時，多糖含量升高，相關性最高的是種莖規格。兩者間的交互作用明顯，具有統計學價值。各因素對多糖含量貢獻（偏η2）由大到小表現為種莖規格＞種莖年齡=種莖規格×年齡。

3 討論

3.1 K-means聚類分級法與種莖規格的應用價值分析

本研究所采用的K-means聚類法，具有運算快速、操作簡便的優勢，時間復雜度近于線性，對大數據集有較高效率且具有可伸縮性，廣泛適用于大規模數據集[23-25]。但該法在種莖分級中也存在一定的局限性：首先，由于K-means聚類法采取均值作為等級劃分界值，分界值存在客觀誤差。在等級劃定時，一、二級的分界值一般采用一級種莖指標的均值，以二、三級的分界值采用二級種莖指標的均值。照此計算，一級種莖實際為指標大于一級均值的種莖；二級種莖實際為一、二級種莖的混合，即小于一級大于二級均值的種莖；三級種莖實為二、三級的混合種莖，即小于二級大于三級均值的種莖。其次，分級指標的設定有主觀因素。在實際操作中大多數種莖無法同時滿足莖長、莖徑和莖重3個指標的分級要求，需要人為的選擇主要指標（如種莖年齡）。基于以上因素，本研究綜合比較出苗率、產量和藥用品質，得出各等級種莖的優劣順序依次為一、二、三級；一級種莖為生產用種為最佳，但成本高，且占比較低(27.3%)，因此，主要生產用種不適合；二級種莖可作為生產適宜用種，其占比較高(51.8%)；三級種莖在3個年齡下的田間出苗率雖然較低，可后期補苗，加之二、三級種莖總量占比達到72.7%，因此，作為主要生產用種較合適。此外，出苗率、單株產量和單位產量與種莖規格、年齡間存在相關性，在相同年齡下各等級種莖間的出苗率、單株產量、單位產量差異顯著，說明種莖分級在多花黃精科學選種用種中具有指導意義。

3.2 種莖年齡對產量和藥用品質的影響

本研究結果顯示，種莖年齡變大，單株產量和單位面積產量降低。可能是種莖年齡變大導致出苗階段生長發育緩慢，后期苗弱，植物弱苗對水分、光能和養分的利用降低[26]，從而影響產量和品質。因此，不同等級的多花黃精種莖應該存在一個年齡臨界值，在該臨界值內，隨年齡變大單株產量和單位面積產量提高，超過臨界值后，單株產量將因多花黃精對水分、光能和養分的利用降低而下降。本試驗發現中在SlA2下多糖含量達到最高(10.85%)，S2A1下達到最低(7.98%)，均高于標準。在不同種莖規格下均表現為二年生多糖含量最高，一年生最低。可能是多花黃精為多年生植物，種莖繁殖一般2～3年收獲，這時黃精種莖生理年齡較適宜，種莖出苗快，植株后期生長發育好，導致多糖積累多。劉躍鈞等[27]研究發現，黃精1齡級根莖，在當年對黃精生長的前期有效促進了黃精地上發芽。同時，肖關麗等[28]發現，馬鈴薯生理年齡會直接影響田間出苗時間、整齊度、苗數和植株長勢等。同時，隨著種薯生理年齡的增加，馬鈴薯種薯的萌芽數、主莖數和單株結薯數增加，但平均薯重下降。另外，張曉偉等[29]在半夏種莖研究中也得出類似現象，半夏播種材料凈增產量和增重比與生理年齡有很大關系，當種莖生理年齡增大時，增重比和增產量隨之降低，2年生珠芽的總生物堿含量顯著高于3年生。因此，適宜的種莖年齡能促進藥材產量和藥用物質的形成，有利于提高產量和藥用品質。年齡太大或太小的種莖產量和品質均有降低現象。

4 結論

本研究發現種莖規格、年齡與出苗率相關，在一定范圍內，隨著種莖規格等級的升高出苗率增高，而隨著種莖年齡的增大出苗率降低。種莖規格與單株產量、單位面積產量極顯著相關，種莖年齡與單株產量、單位面積產量顯著相關，當種莖規格升高時，產量增加；當種莖年齡變大時，產量降低。種莖規格與多糖含量極顯著相關，種莖年齡與多糖含量顯著相關，在一定范圍，當種莖規格、年齡逐漸升高時，多糖含量升高，相關性最高的是種莖規格。

綜上，推測種莖規格與年齡存在交互作用，高級、低齡多花黃精種莖適宜作種，能顯著提高多花黃精藥材產量和藥用品質。