藥用植物滇黃精寄生真菌的分離與鑒定

譚 偉，浦仕彪

（云南中醫藥大學，昆明 650500）

0 引言

滇黃精(Polygonatum kingianum)為百合科黃精屬多年草本植物[1]。據《中國藥典》2015版記載，黃精為百合科植物滇黃精(Polygonatum kingianum)、黃精(Polygonatum sibiricum)或多花黃精(Polygonatum cyrtonema)的干燥根莖，滇黃精是中藥黃精3種基源植物之一[2]。《中國植物志》記載，滇黃精主要分布于中國西南地區，主產于云南，具有悠久的用藥歷史[3-4]。現代研究確定滇黃精中含有多糖、甾體皂苷、黃酮、蒽醌類化合物等多種化學成分，具有降血糖、降血脂、抗衰老、提高免疫力、抗炎、抗腫瘤等多種作用[5-8]，因此具有較高的藥用價值和保健功效。隨著以黃精為主要原料的各類保健酒、飲料、化妝品等養生保健品[9-10]市場需求的不斷擴大，黃精的資源壓力巨大。滇黃精已在云南多地進行人工栽培，隨著種植面積不斷擴大，其病害也日益嚴重。陳澤歷等[11]研究認為大面積單一種植滇黃精會導致病害發生變得嚴重。云南多地為了提高滇黃精的種植效益，對滇黃精的栽培技術進行了研究。尤俊榮等[12]探索云南松林下滇黃精的栽培技術，刀立華等[13]在云南普洱市景谷鎮探索山地茶園套種滇黃精。王橋美等[14]發現滇黃精病害主要有黑斑病、葉斑病、軟腐病、炭疽病、根腐病等，其病害多為真菌侵染性病害。田啟建等[15]發現貴州黃精的主要病害種類為黑斑病、葉斑病和炭疽病，它們的病原均為半知菌亞門真菌。嚴吉明等[16]對四川省54種藥用植物進行病原鑒定，鑒定出病害115種，其中大部分為真菌侵染性病害。黃劍等[17]對貴州省53種藥用植物進行病害調查，發現真菌性病害為38種。藥用植物主要病害為真菌侵染性病害。該種病原真菌寄生于活體植物，并從宿主攝取營養，在其體內生長繁殖，對宿主產生極大危害，產生一系列病理性癥狀。許多植物體內除了含有致病性真菌外，還有對植物體有益的內生真菌[18]，它是某一段時期生活在植物組織內，對植物組織沒有引起明顯病害癥狀的一類真菌。植物與內生真菌互利共生，內生真菌能增強植物抗病害能力，它分泌的代謝產物能促進植物生長，內生真菌已廣泛應用于生物制藥、農業等領域[19]。筆者對滇黃精寄生真菌進行分離與鑒定，以期為其病害防治提供理論依據和技術參數。

1 材料與方法

1.1 材料

采集麗江華坪縣、麗江玉龍縣魯甸鄉的滇黃精全株各12株。

1.2 方法

1.2.1 真菌的分離與鑒定

（1）樣品保濕培養。將進行過表面處理的滇黃精樣品按部位切割成大小合適的小樣品，置于事先用酒精擦拭過且晾干的保鮮盒中，在盒子的對角處放置大小合適的棉花，并向棉花中滴灑無菌水，直到浸透棉花且不溢出，蓋上保鮮盒蓋子，時常不斷觀察直至樣品表面長出真菌。

（2）分離和純化。對長出真菌的樣品，于超凈工作臺上用滅菌接種針挑取少量的菌絲并接種于PDA培養基中，均勻地在培養基上點3個點，并做好標記。此過程可根據樣品上有幾種不同顏色、形態等明顯區分的菌落，挑取對應的皿數。待真菌長出后觀察同一皿中顏色、形狀等是否有差距，如果有進行下一輪純化，直至長出的真菌沒有污染，屬于同一種菌即可。

1.2.2 形態學鑒定 觀察并記錄PDA培養基中菌落的直徑、顏色、形態的變化及生長速度。DNA提取前，在光學顯微鏡下觀察并記錄菌絲及孢子形態特征[20-21]。參考《真菌鑒定手冊》[22]、《中國真菌志》[23]等，初步鑒定寄生真菌。

1.2.3 分子生物學鑒定 采用CTBA法[24-29]提取真菌基因組DNA。ITS擴增使用的引物ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')和ITS5(5'-GGAAGGTAAAAGTCAAGG-3')，兩者為通用引物，由昆明擎科生物有限公司合成。50 μL PCR反應體系為10 μL 10×PCR Buffer、0.25 μL dNTPs(10 mmol/L)、1 μL ITS4、1 μL ITS5、0.3 μLTaq酶、1 μLDNA模板，用ddH2O補足50 μL。擴增程序為94℃ 4 min，94℃ 1 min，54℃ 1 min，72℃1 min，33個循環，72℃ 3 min，4℃保存。

擴增產物由昆明擎科生物有限公司測序。測序結果通過Chromas軟件校對，以每個形態型菌株的ITS序列作為靶序列，在NCBI的GenBank數據庫中通過Blast搜索，將相似度最高的序列作為參考序列。確定序列的有效性；打開序列文件并復制該序列；打開NCBI網站，進入BLAST功能區域選擇Nucleotide BLAST；粘貼序列于序列框，輸入序列編號，勾選“show results in a window”；點擊BLAST；根據ident（百分比）確定所測樣品序列的分類地位。RensKe Landeweer等[30]認為通過ITS區域比對，序列相似性大于99%，鑒別為相同種；序列相似性大于95%且小于99%，鑒別為相同屬；序列相似性小于95%，鑒別為相同科。

2 結果與分析

2.1 形態鑒定

采于玉龍縣魯甸鄉的滇黃精分離培養得到15皿寄生真菌菌落，采于華坪縣的滇黃精分離得到22皿寄生真菌菌落。同時，對兩地滇黃精寄生真菌菌落進行觀察和具體形態特征的統計分析（圖1～2、表1～2）。

表1 玉龍縣魯甸鄉黃精寄生真菌菌落統計及具體形態特征

表2 華坪縣黃精寄生真菌菌落統計及具體形態特征

圖1 玉龍縣魯甸鄉滇黃精寄生真菌菌落形態

圖2 華坪縣滇黃精寄生真菌菌落形態圖

2.2 分子生物學鑒定結果

序列比對結果顯示，玉龍縣魯甸鄉15株寄生真菌菌落中包括1株青霉屬、12株尖孢鐮刀菌、1株木賊鐮刀菌、1株鏈格孢菌，鐮刀菌（木賊鐮刀菌、尖孢鐮刀菌）占總菌落的86.66%，可初步認定其為優勢寄生種。華坪縣22株滇黃精寄生真菌菌落中包括12株黑綠木霉、9株芬芳鐮刀菌、1株木賊鐮刀菌，黑綠木霉占總菌落的54.5%，可初步認定其為優勢寄生種（表3～4）。

表3 玉龍縣魯甸鄉滇黃精寄生真菌DNA序列與NCBI數據庫比對結果

表4 華坪縣滇黃精寄生真菌DNA序列與NCBI數據庫比對結果

3 討論

由麗江華坪縣和玉龍縣魯甸鄉兩地滇黃精寄生真菌分離與鑒定結果可知，鐮刀菌屬真菌是滇黃精主要的致病真菌，其次是木霉屬真菌，試驗中木霉菌屬只發生于華坪縣滇黃精中。鐮刀菌屬擁有多種致病菌，具有致病范圍廣和治病能力強等特點，可引起植物的萎蔫、穗腐和根腐等多種病癥，如小麥赤霉病、香蕉枯萎病和棉花枯萎病，已成為世界上重要的致病真菌之一[30]。因此兩地在進行滇黃精種植病害防治時，應以鐮刀菌屬真菌為主要防治對象，合理采取防治措施。

滇黃精作為藥食兩用的傳統中藥資源，具有較大的市場需求。已有文獻中關于滇黃精病害的研究報道較少，其中王橋美等[14]認為滇黃精主要病害有葉斑病、黑斑病、炭疽病，葉斑病和黑斑病的致病真菌主要為鏈格孢屬(Alternaria)。楊林毅[31]對采于云南曲靖的滇黃精進行病原真菌的分離鑒定，得到主要致病真菌為腐皮鐮刀菌(Fusarium solani)。筆者從麗江滇黃精中分離鑒定得到鐮刀菌屬真菌，其中采于玉龍縣魯甸鄉的滇黃精還分離得到鏈格孢屬真菌，與2篇報道有共性之處。但鐮刀菌屬真菌是滇黃精普遍的致病真菌仍需要進一步研究。各地在滇黃精病害防治時，應該因地制宜，采取科學有效的方法進行病害防治。