茵陳質量標志物的預測

吳 磊，賈利軍，鐘林江，戴 靜，劉前呈，賀英俊，伍文彬

(1.成都大學 食品與生物工程學院，四川 成都 610106;2.太極集團 四川太極制藥有限公司，四川 成都 610207；3.成都大學 四川抗菌素工業研究所,四川 成都 610052;4.成都中醫藥大學 附屬醫院,四川 成都 610072)

0 引 言

茵陳為菊科植物濱蒿或茵陳蒿的干燥地上部分,具有利濕退黃與清熱解毒的功效，主要用于治療黃疸與濕疣等疾病.茵陳的主要成分包括有機酸類、黃酮類、香豆素類及揮發油類等[1-2].茵陳的現代藥理作用有解熱、鎮痛、抗炎、抗病毒、抗腫瘤、降血壓、調血脂、抗骨質疏松、神經保護、調節代謝及預防阿爾茨海默病等多種功效[2].中藥質量標志物(Q-marker)是中藥質量控制的新概念，基于中藥傳遞與溯源、有效、特有、可測和處方配伍的“五原則”[3]，可建立中藥全程質量控制及質量溯源體系，為中藥質量控制提供了新的思路.本文基于 Q-marker 理論，運用網絡藥理學和文獻分析對茵陳潛在 Q-marker進行預測，為整體控制茵陳的質量提供參考依據.

1 數據庫和相關軟件

TCMSP數據庫(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php),Uniprot數據庫(https://www.uniprot.org/),GeneCards數據庫(https://www.genecards.org),在線韋恩圖(http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html),DAVID 6.8.0數據庫(https://david.ncifcrf.gov/),Omicshare數據庫(http://ww.omicshare.com)，STRING數據庫(https://string-db.org/)，GraphPad Prism 6.0軟件及Gytoscape 3.7.2軟件等.

2 方法與Q-marker預測

2.1 基于網絡藥理學的茵陳成分有效性的Q-marker預測

2.1.1 茵陳活性成分及靶點的篩選

運用中藥系統藥理學數據庫和分析平臺 TCMSP，以“茵陳”為關鍵詞進行化學成分搜索，以口服生物利用度(OB)≥30%和類藥性(DL)≥0.18為篩選條件，進行茵陳活性成分的篩選，共得到13種活性成分(見表1).同時，利用 TCMSP 數據庫收集茵陳活性成分的靶標蛋白.借助Uniprot數據庫，將靶標蛋白名稱導入，物種限定為“Human”，檢索得到的所有靶標蛋白校正Uniprot ID，并得到靶標蛋白所對應的基因名.

表1 活性成分基本信息

2.1.2 交集基因的篩選

茵陳的主治疾病為黃疸和濕疹.黃疸臨床常見疾病有急慢性肝炎、肝硬化、膽結石及消化道腫瘤等.以急性肝炎、慢性肝炎、病毒性肝炎、肝硬化、膽結石、消化道腫瘤和濕疹為疾病，利用GeneCards數據庫查找以上疾病的基因，選擇每種疾病的前 300個基因排列在一起，作為藥物的疾病基因，共獲得疾病基因1 050個.利用在線韋恩圖，將成分基因和疾病基因導入，得到交集基因共81個，結果如圖1所示.

圖1 茵陳相關靶點在線韋恩圖

2.1.3 GO分類富集分析

將所得到的81個靶點導入STRING數據庫進行GO功能富集分析，得到GO條目1 892個，其中生物過程條目1 648個，細胞組成條目 82個，分子功能條目162個，分別占 73%、13%、14%.其中，生物過程主要涉及氮化合物代謝過程的正調控、大分子代謝過程的正調控、細胞過程的正調控、刺激反應的調節、細胞對有機物質的反應、細胞對化學刺激的反應及對含氧化合物的反應等過程；分子功能主要涉及激活轉錄因子結合、蛋白質結合、酶結合及蛋白質異構化活性等功能；細胞組成涉及在膜結合細胞器、細胞質部、胞外區及細胞器等區域.3個分支數量排名前20位相關條目信息柱狀圖如圖2所示.

圖2 GO分類富集分析圖

2.1.4 KEGG通路富集分析

利用DAVID6.8.0數據庫對81個靶點進行通路富集分析，得到281條信號通路(P<0.05)，涉及癌癥、乙型肝炎和TNF信號通路等，表明這些靶點可能主要通過調控這些通路達到干預疾病的目的.前20位信號通路氣泡圖如圖3所示.

圖3 信號通路氣泡圖

2.1.5 “成分—靶點—通路”網絡構建及分析

將富集分析得到的排名前20的通路所對應的57個作用靶點及13種成分，運用Cytoscape 3.7.1軟件構建“成分—靶點—通路”網絡，根據網絡的拓撲學性質度值排序確定關鍵節點，在所構建的網絡中，依據Degree值(度值)確定關鍵節點，度值>中位數(成分度值中位數=3，靶點度值中位數=15，通路度值中位數=14)的成分有4種，靶點有 28個，通路有10條.4種成分為槲皮素、異鼠李素、β-谷甾醇及茵陳蒿靈A，度值分別為55、8、7和5，由于該4種化合物在網絡中具有較高的連接度，提示這可能是茵陳發揮藥效的主要活性成分.靶點的關鍵節點分別是AKT1、TNF、JUN、MAPK1、RELA、TP53及IL6，度值分別是 38、37、37、36、36、34及31，表明這可能是茵陳化合物作用于癌癥、腫瘤、乙肝與病毒等信號通路潛在的關鍵作用靶點.網絡藥理學研究從成分有效性角度提示槲皮素、異鼠李素、β-谷甾醇及茵陳蒿靈A等成分可作為茵陳潛在 Q-marker 進行深層次研究.

2.2 基于原植物親緣學及化學成分特有性證據的Q-marker預測

茵陳為菊科多年生長草本植物艾屬濱蒿或茵陳蒿的干燥地上部分.艾屬中除了茵陳蒿，還有艾草、青蒿及牡蒿等植物.艾屬中揮發油屬于其主要次生代謝產物，是艾屬類植物的主要藥效部位之一，用其作為Q-marker的預測有一定的意義.艾屬藥材中的揮發油主要以倍半萜類化合物為主，萜類化合物的生源途徑均為甲戊二羥酸途徑，由焦磷酸香葉酯(GPP)衍生成無環單萜或者通過異構化酶作用轉化成焦磷酸橙花酯(NPP)，再生成各類環狀單萜[4].其中茵陳的代表成分有大牛兒烯D、α-葎草烯及石竹素等.茵陳根據其采收時節可分為綿茵陳和茵陳蒿，春季采收為綿茵陳，秋季采收為茵陳蒿.由于采收時節的不同，茵陳所含的成分出現了差異，相關標準收載綿茵陳的含量測定中綠原酸含量不少于 0.5%，茵陳蒿的含量測定中濱蒿內酯不少于 0.2%[5].通過分析艾屬的親緣關系，可將大牛兒烯D、α-葎草烯及石竹素作為茵陳的Q-marker.

2.3 基于傳統功效的Q-marker預測

中藥的傳統功效是在中醫理論指導下，通過長期的實踐總結而來的有效使用方法，因此基于傳統功效對茵陳的質量標志物預測有一定的必要性.茵陳的使用歷史比較久，《神農本草經》記載將其列為上品，《傷寒論》中記載茵陳用來治療瘀熱發黃，《千金方》中其用來治療風癢疥瘡，《金匱要略》中其用來治療黃疸濕重熱少.茵陳能夠利濕退黃、清熱解毒，在治療黃疸方面是一味非常重要的中藥材.茵陳的現代藥理作用有利膽、保肝、解熱鎮痛、抗炎、抗病毒、抗腫瘤及降血壓等作用.王守軍[6]研究發現，萜類化合物具有抗腫瘤、鎮定、抗病毒及提高免疫力等效果.廖天錄等[7]研究發現，香豆素具有利膽作用.牛篩龍等[8]研究發現，總黃酮對急性肝損傷具有保護作用.茵陳萜類化合物、香豆素類和黃酮類與其有效性密切相關，作為主要藥效物質基礎，可考慮作為茵陳的潛在Q-marker.

2.4 基于傳統藥性的Q-marker預測

“性味”即四氣五味，是中藥的特有屬性，反映了中藥的本質特征，是中藥藥性理論的核心[9].中藥臨床藥理研究表明，中藥的化學成分與其藥性具有一定的相關性[4].茵陳味苦、辛，性微寒，歸肝、膽、脾經.研究表明，苦、寒藥物的物質基礎以生物堿和苷類成分為主[10]，辛味藥的化學成分多以黃酮類、萜類和揮發油為主[11]，結合茵陳含有的化學成分種類，可將萜類化合物和黃酮類化合物作為茵陳質量標志物的Q-marker.

2.5 基于化學成分的Q-marker預測

陳志娜等[12]研究發現，用70%乙醇提取茵陳得到總黃酮(主要成分為金絲桃苷和槲皮素)與總多酚含量最高,抗氧化活性最強.張影等[13]以綠原酸為內參物，計算茵陳標準湯劑中新綠原酸與咖啡酸等7種成分的相對校正因子，從而計算出7種成分的含量，并與常規外標法實測含量值沒有顯著差異，一測多評法可作為茵陳標準湯劑多指標成分定量分析的首選方法.熊耀坤等[14]利用GC-MS 法對茵陳提取的揮發油成分進行鑒定分析，得出茵陳鮮品的揮發油含量高于茵陳干品，應注意茵陳產地加工干燥過程的質量控制和藥材保障.張慧等[15]利用分光光度法，以獐牙菜苦苷為對照品，經HCl水解,2,4-二硝基苯肼乙醇試液和NaOH 60%乙醇溶液顯色后,于444 nm波長處測定藏茵陳總環烯醚萜苷含量，該方法準確、簡單、穩定性好，可用作測量總環烯醚萜苷含量的首選方法.吳小可等[16]采用HPLC法，以甲醇和 0.2%的甲酸(48∶52)為流動相測定菊科植物中總黃酮醇苷含量，結果表明，槲皮素、異鼠李素2種黃酮類化合物分別在1.06～212 μg/mL、0.93～186 μg/mL 濃度范圍內線性關系均良好，該方法可作為茵陳槲皮素和異鼠李素含量測定的一種方法.茵陳色原酮對急性乙醇性肝損傷具有保護作用，可在體內與人血清白蛋白結合而發揮穩定的生物活性作用，可抑制β-葡萄糖醛酸酶的活性，使葡萄糖醛酸不被分解，從而加強肝臟解毒作用[17].麥爾旦·吐爾遜麥麥提等[18]利用薄層層析、硅膠反復柱層析、波譜分析技術和理化常數對照的方法，從 80%乙醇提取物中分離并鑒定出了茵陳色原酮，且對其碳譜數據進行了歸屬.張啟偉等[19]利用UV、MS與HNMR確定茵陳中3′-甲氧基薊黃素的結構，采用HPLC分離與面積歸一化法計算3′-甲氧基薊黃素含量，可用作3′-甲氧基薊黃素定量分析的方法.馮藝飛[20]利用大孔吸附樹脂對茵陳總黃酮進行分離純化，通過顯色反應、紅外光譜、液質聯用、FT-IR譜圖及LC-MS分析等方法，確定出茵陳提取物中含有黃酮類化合物，并推斷鑒定出含蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、異鼠李素-3-O-葡萄糖苷和香葉木苷幾種成分.廖彥等[21]利用HPLC 指紋圖譜、RRLC-MS/MS 及HPLC-DAD方法確定了茵陳的8個共有峰并對8個共有峰的化學成分進行了指認.李楊楊等[22]利用 HPLC方法，將濃度設置在3.9～500 μmol/L內可以使得6，7-二甲氧基香豆素的峰面積之間的線性關系良好.以上多種成分可為茵陳Q-marker的預測提供一定的參考.

3 討 論

茵陳作為我國的傳統中藥，其資源豐富，藥用歷史悠久，且臨床療效突出.相關研究表明，茵陳具有利膽、保肝、降血壓、抗腫瘤、抗病毒、解熱鎮痛以及提高免疫功能等作用.茵陳中的化學成分復雜，容易受采收時節的影響.現行標準將茵陳中的綠原酸作為其指標，但綠原酸屬于苯丙素類化合物，在其他植物中也存在，如金銀花等.因此，建立科學、合理的質量評價方法，對茵陳的質量進行全面準確地評價并指導茵陳資源的合理開發利用以及對茵陳產業的健康發展具有重要的現實意義.

本研究依據Q-marker 理念，基于網絡藥理學從成分有效性的角度對茵陳進行研究，發現茵陳成分中 13 個活性成分可通過AKT1、TNF、JUN、MAPK1、RELA、TP53及IL6等靶點作用于癌癥、乙型肝炎及TNF等關鍵信號通路發揮藥理作用.并對茵陳的生源途徑和成分特異性、傳統功效、傳統藥性以及化學成分可測性進行了預測.利用網絡藥理學方法來篩選出數據庫中的有效成分并與其他預測方法的結果進行比較，可以豐富篩選成分，有利于更好地確定Q-marker.結果表明，茵陳的黃酮類成分主要有槲皮素與異鼠李素，揮發油的主要成分為大牛兒烯D，甾醇類主要化合物為β-谷甾醇，香豆素類的主要化合物為6，7-二甲氧基香豆素與馬栗樹皮素二甲醚，色原酮類化合物主要為茵陳色原酮.研究表明，槲皮素、異鼠李素和β-谷甾醇廣泛存在于大多數的藥用植物中，不符合成分特有性的特點，不適合作為茵陳的Q-marker.而茵陳蒿靈A屬于茵陳特有成分，馬栗樹皮素二甲醚存在于茵陳花序和花蕾部分，且在花蕾中含量最高，在開花季節其含量可達1.98%，隨即迅速降低，具有可檢測特點，而大牛兒烯D是茵陳揮發油的主要活性部位，6，7-二甲氧基香豆素和茵陳色原酮具有利膽，促進膽汁分泌的作用，體現了茵陳的主要藥效作用，以上幾種成分可以為茵陳Q-marker的控制和篩選提供科學的理論依據，以便于建立合理的茵陳質量控制及溯源體系.

Q-marker的預測途徑在劉昌孝院士最初提出的傳遞與溯源、有效、特有、可測及處方配伍的“五原則”基礎上，又衍生出了藥動學與體內過程相關性，不同產地化學成分特有性，可入血化學成分以及不同加工方法等途徑.Q-marker的預測途徑的增多，篩選出來的成分也越來越多，使得Q-marker的預測也產生了一定的問題.如，根據不同預測途徑篩選出一定的Q-marker，應該通過怎樣的方式對篩選出來的Q-marker進行取舍；根據植物的親緣性進行Q-marker的預測，遇到不同科，不同屬的植物含有相同的成分，那么該成分屬于哪一種植物的Q-marker；Q-marker的預測是根據什么標準來確定其可以作為質量標志物；Q-marker的預測主要是通過查閱文獻進行內容整合，但是忽略了中藥成分的未知性的特點，那么現已預測的Q-marker是否準確等等.網絡藥理學主要是利用現有的中藥數據庫完成高通量的計算機虛擬篩選，將已有的數據進行分析和整合來獲取相關的成分、靶標與通路.中藥材具有多成分與多靶點的特點，不同藥材中含有相同成分，利用網絡藥理學方法來篩選出數據庫中的有效成分與其他預測方法的結果進行比較，可以豐富篩選成分的多樣性，有利于更好地找出Q-marker.但網絡藥理學篩選的是藥材中含有的成分，并沒有將單味藥材中特有成分或加工過程中形成的可以定性定量的特有化合物區分出來.文獻分析是有目的性地去篩選單味藥材，將藥材各個方面的研究結果歸納總結起來，如將炮制工藝、采收時節與藥材配伍等因素考慮在內得出的具有專屬性、有效性和安全性的化學成分.因此會出現網絡藥理學研究結果和文獻分析結果矛盾的情況.因此，Q-marker的建立應該建立在“位”“量”“性”“效”的基礎上，利用網絡藥理學與文獻分析等方法來實現Q-marker的定位，利用代謝組學與含量測定等方法來實現量的確定，利用指紋圖譜與判別分析來實現定性鑒別，最后利用體內體外藥理實驗來實現效的驗證.只有將“位”“量”“性”“效”結合起來，綜合分析得出的結論才具有可信度，才可以為質量標準的建立提供依據.